Dr. Kaan AYDOS
Azoospermi, ejakulatta hiç sperm bulunmaması anlamına gelir ve erkeklerin %1’inde (Willott, 1982), infertilite yakınması olanların ise %10-15’inde (Jarrow, 1989) rastlanılır. Sperm taşıyan kanallarda herhangi bir obstrüksiyonun bulunmamasına rağmen, ejakulat analizinde azoospermi bulunması ise nonobstrüktif azoospermi olarak tanımlanır. Azoospermi tanısı ejakulatın 3000 g hızda 15 dk santrifüj edilmesini takiben, mikroskop incelemesinde pellette hiç sperm bulunmaması durumunda konulur (WHO, 1999). En az 1 ay aralıkla yapılacak iki analiz ile tanı kesinleştirilmelidir. Bazı çalışmalardan elde edilen bulgulara dayanarak, klinik varikosel ve hormonal bozukluklar gibi düzeltilebilir faktörlerin tedavi edilmelerini ya da eğer mevcutsa gonadal toksik maddelerin kesilmesini takiben 3 ay sonra sperm analizinin yeniden kontrol edilmesi de uygun olur (Schlegel, 1999b).
Nonobstrüktif azoospermide spermatogenezde değişik derecelerde bir bozulma söz konusudur. Testislerin histopatolojik incelemesinde azoospermi nedeni olarak komplet germ hücre aplazisi (Sertoli cell-only sendromu veya Del Castillo sendromu), fokal spermatogenez gösteren Sertoli cell-only sendromu, spermatogonium, spermatosit veya yuvarlak spermatid seviyelerinde maturasyon duraklaması, parsiyel maturasyon duraklaması, hipospermatogenez ve komplet sklerozis bulunur. Sıklıkla hormonal, genetik ve testislerde intrensek spermatogenez bozukluğuna yol açan faktörlere bağlı olarak gelişebilir (Weidner, 2002).
Erkek faktörü infertilite olgularının tedavisinde en önemli ilerleme, nonobstrüktif infertilite olgularında testislerde spermatogenezin devam ettiği küçük odakların gösterilerek, birden fazla biyopsi ile bu odaklardaki matür sperm hücrelerinin elde edilmesi (testiküler sperm ekstraksiyonu; TESE) olmuştur. Elde edilen hücreler ICSI‘de (intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu) kullanılarak sağlıklı gebelikler sağlanabilmektedir. TESE ile bu olguların %24-81’inda spermatozoa elde edilebilmesine ve %18 ile 38 arasında gebelik sağlanabilmesine rağmen, yine de testis biyopsilerinde total germinal aplazi ya da maturasyon duraklaması bulunan erkeklerin %58-76’sında, sperm elde edilmesinde başarısız kalınmaktadır (Tournaye, 1997; Schlegel, 1999b; De Geyter, 2000; Aydos, 2001a). Hipospermatogenez ve fokal spermatogenez gösteren Sertoli cell-only (SCO) sendromunda bu oran daha da yüksek olmaktadır. Burada en önemli sorun hangi olgularda matür sperm bulunabileceğinin önceden tahmin edilememesi ve uygulamadaki teknik faktörlerdir.
Azoospermik bir hastada testislerinde sperm bulunup bulunmadığını kesin olarak ortaya koyacak herhangi bir klinik test yoktur. Bununla birlikte, tedavi planının yapılmasında klinik verilerin ve laboratuvar testlerinin katkısı bulunabilir. Bu amaçla hastanın medikal hikayesinde daha önceki fertilite durumu, orşit, inmemiş testis gibi çocukluk dönemine ait hastalıkları, genital veya pelvik travma hikayesi, inguinal ameliyatlar, epididimit veya uretrit ile seyretmiş enfeksiyon hikayesi, radyasyon ya da kemoterapi gibi gonadal toksiklere maruziyet, yakın zamanda aldığı medikal tedaviler, ateşli hastalıkları ve yüksek ısıya maruz kalma durumu ile ailede doğumsal anomaliler, mental retardasyon, fertilizasyon problemleri veya kistik fibrozis olgularının varlığı sorgulanmalıdır. Fizik muayenede testis boyutları ve yoğunluğu, sekonder seks karakterleri, vücut yapısı, kıl dağılımı, jinekomasti, vaz deferenslerin varlığı, epididimlerde sertlik, varikosel ve rektal muayenede prostat araştırılmalıdır.
Testis içinde spermatogenezin topografik dağılımı volüm ile bir ilişki göstermediği için, TESE’de hücre bulma olasılığını tahmin etmede testis volümü tayini yol gösterici özelliğe sahip değildir. Histopatolojisi SCO sendromu olmasına rağmen normal volüm gösteren bir testiste, spermatozoa bulma şansı da düşük olacaktır. Diğer yandan, küçük volümlü bir testis, maturasyon duraklaması gösterse bile TESE’de hücre bulunamıyacağını da ifade etmez (Devroey, 1995). Normal volümlü testislerin ancak %44’ünde sperm elde edilebilirken, çok küçük volümlü testislerin de %25’inde yine hücre bulunabileceği bildirilmiş olup, volüm < 5ml testislerde de ICSI’de kullanılmak üzere matür spermatozoa elde edilebilmektedir (Amer, 2001).
Nonobstrüktif azoospermi olgularında ejakulat volümü genellikle normal bulunmakla birlikte, hipogonadizimde volüm azalabilir. Bu nedenle ayırıcı tanıda tek başına bir değeri yoktur.
Azoospermi olgularında temel endokrinolojik tetkikler serum follikül stimüle edici hormon (FSH) ve testosteron ölçümleridir. FSH; Sertoli hücreleri üzerinden hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler gibi değişik proteinlerin yapımını uyararak ya da inhibe ederek testis fonksiyonlarını düzenler (Sharpe, 1994). Hipofizden FSH salınımı ise esasen Sertoli hücreleri tarafından yapılan inhibin B tarafından kontrol edilir. İnhibin B testosteron ile birlikte diürnal bir ritim gösterir. Sabah en yüksek değerine ulaşırken akşama doğru düşme eğilimindedir (Carlsen, 1999). Sağlıklı ve infertil erkeklerde inhibin B’nin sabah ölçülen serum konsantrasyonları FSH, sperm sayımı ve testis volümü ile de korele bulunmuştur (Eckardstein, 1999). İnhibin B germ hücrelerinin ve Sertoli hücrelerinin fonksiyonel durumunun direkt bir göstergesi olarak kabul edilmektedir. İnhibin B salgılanmasının kontrolünde germ hücrelerinin rolü bulunduğu ortaya konmuştur (Pineau, 1990). Rat testisinde, seminifer tubüllerden inhibin B salgılanması esasen spermatidlerin varlığına bağlıdır (Allenby, 1991). İnhibin B düşük ise, spermatidlerin de bulunmadığı sonucuna varılabilir. Her ne kadar nonobstrüktif azoospermi olgularında serum inhibin B düzeyleri belli bir değerin altına düştüğünde TESE’de sperm bulma şansının anlamlı derecede azaldığını ve bu nedenle inhibin B’nin TESE sonuçlarını predikte ettirmede değerli bir markır olduğunu bildiren çalışmalar mevcutsa da (Ballesca, 2000; Brugo-Olmedo, 2001), bunun aksine TESE’de predikte ettirici bir rolü olmadığı da gösterilmiştir (Garem, 2002; Guthauser, 2002). İnhibin B ve FSH’nın birlikte değerlendiriminin daha anlamlı olacağı da önerilmektedir (von Eckardstein, 1999). Burada inhibin B salgılanması üzerine etkili başka faktörlerin rolünün olması olasıdır.
Testiküler spermatogenetik yetmezlik primer ya da sekonder gelişmiş olabilir. Bu ikisinin ayırt edilmesinde FSH ve testosteron’un birlikte değerlendirimi önemlidir. Normal veya düşük testosteron ile birlikte FSH’nın yükseldiği durumlarda primer testiküler yetmezlik düşünülmelidir. FSH’nın düşüklüğü ise hipotalamus-hipofiz kaynaklı sekonder testiküler yetmezlik ile uyumludur. Vazal agenez bulunmadığı ve testis boyutlarının normal sınırlar içerisinde ölçüldüğü durumlarda azoosperminin kaynağını ortaya koymada FSH ile birlikte ejakulat volümü de faydalı olabilir. Böyle erkeklerde eğer ejakulat volümü normal ise proksimal seviyede bir obstrüksiyon ya da testiküler yetmezlik olasıdır. Ejakulat volümünün düşüklüğü ejakulatör kanallara ait obstrüksiyon ya da fonksiyon bozukluğunu düşündürürken, FSH’daki yükselme primer testiküler yetmezliğe işaret eder. Özellikle FSH’nın normalin 2 katı yükselmesi spermatogenezde bozulma olduğunun göstergesidir.
İnfertil erkeklerin tanısal araştırmalarında serum FSH ölçümü geniş çapta kullanılmakla birlikte, FSH, azoosperminin yapısı ve testis dokusunda spermatozoa varlığı bakımından yeterli olmamaktadır. Özellikle, testislerden sperm elde edilerek ICSI yapılması düşünüldüğünde, testislerde sperm bulunma durumu ile serum FSH sonuçları arasında bir ilişki yoktur. FSH esasen seminifer tubüllerde bulunan spermatogoniumların sayısı ile ilişkilidir, matür spermatid sayısı ya da ejakulattaki spermatozoa konsantrasyonu ile yakın bir korelasyon vermez (DeKretser, 1974). Bu nedenle spermatogenetik duraklama gösteren testis patolojilerinde FSH normal bulunabileceği gibi, FSH’nın normal bulunması da her zaman testislerde normal spermatogenezin varlığına işaret etmez (Jarow, 2002). FSH ile karşılaştırıldığında, azoosperminin şeklini inhibin B daha doğru yansıtır. Özellikle Sertoli cell only sendromu’nda muhtemelen Sertoli hücresindeki hasar nedeniyle serum konsantrasyonu en düşük seviyesine iner (von Eckardstein, 1999). Ancak serum FSH düzeyleri ile inhibin B düzeyleri arasında her zaman aynı uyum görülmeyebilir. Örneğin bir grup oligozoospermik erkekte yükselmiş serum FSH’sı ile birlikte normal inhibin B düzeyleri bildirilmiştir (Foresta, 1999). Dolayısıyla, ne çok yükselmiş serum FSH seviyesi ne de düşmüş inhibin B düzeyi TESE sırasında spermatozoa elde edilebileceğini ekarte etmemektedir (Jezek, 1998).
Azoospermi olgularında tedaviyi planlamak açısından tanısal testis biyopsisi alınmasının bir değeri yoktur. Biyopside sperm bulunmuş ya da bulunmamış olması, testisin diğer yerlerinde de sperm bulunacağı ya da bulunmayacağını kesin olarak göstermez (Jarow, 2002). Yukarıda belirtildiği gibi, biyopsi sonucu spermatogenezde değişik derecelerde anormallik gösterse bile, TESE ile bu olguların %24-81’inda spermatozoa elde edilebilmektedir. Testis boyutları, ejakulat volümü, serum FSH ve testosteron değerlerinin normal bulunduğu olgularda olası bir obstrüksiyondan şüphelenilerek rekonstrüktif amaçlı skrotal eksplorasyon yapılmalı, bu sırada istenirse testis biyopsisi de alınabilir. Aynı seansta elde edilen sperm, ileride kullanılmak üzere dondurularak saklanılabilir. Eğer klinik ve laboratuvar bulgulara göre nonobstrüktif azoospermiden şüpheleniliyorsa, hastaya gerekli açıklamalarda bulunulduktan sonra TESE yapılmalı ve aynı seansta tanısal amaçlı testis biyopsisi alınmalıdır. İlk uygulamada sperm bulunan olguların %11’inde ikinci uygulamada sperm bulunamaması nedeniyle (Friedler, 2002), TESE ile sperm elde edilirse dondurularak saklanmalıdır. Testis biyopsisi, düşük olasılıkda rastlanılsa da intratestiküler in situ karsinom’u tespit edebilir.
ICSI’de kullanılmak üzere testislerden sperm elde etmek amacıyla randomize biyopsiler alınması durumunda, sperm bulunabilmesi için çok sayıda biyopsinin alınması ve fazla miktarda doku çıkarılması gerekebilir. Sperm bulunana kadar biyopsi alma işlemine devam edilmelidir. Burada çıkarılması yeterli olabilecek maksimum biyopsi sayısı tandardize edilmiş değildir. Randomize biyopsilerin genellikle üst kutup-alt kutup- rete testisin uzağında iç kenar ve dış kenardan olmak üzere 4 adette sınırlandırıldığı görülmektedir. Birden fazla biyopsi dokusunun çıkarılması, tek parça çıkarılmasına göre sperm bulma şansını anlamlı ölçüde artırır (Amer, 1999). Ancak bu durum testislerde hematom ve travma riskini de beraberinde getirir. Doku travması ve kaybının küçük testislerde serum testosteronunda geçici düşüş yapması da olasıdır (Weidner, 2002). İnce iğne aspirasyon biyopsisi yapıldığında ise çok sayıda iğne batırılmasına bağlı hematom ve travma riski oluşturmasının yanısıra, sperm elde etme başarısı da açık biyopsi ile elde edilen başarıdan düşük kalmaktadır. Bu nedenle nonobstrüktif azoospermi olgularında gerek kanama ve hematom oluşma riskini azaltmak gerekse matür seminifer tubülleri ayırt ederek sperm bulma şansını arttırmak amacıyla mikrocerrahi teknik kullanılarak TESE yapılması önerilmektedir (Schlegel, 1999a).
Nonobstrüktif azoospermi olgularında ilk TESE denemesinde sperm bulunamayan olguların %25’inde ikinci denemede hücre bulunabilmektedir. Bunda da sperm bulunamaz ise yapılması gereken maksimum TESE uygulama sayısı 4 olarak önerilmektedir. Daha fazla teşebbüs hücre bulma şansını artırmamaktadır (Friedler, 2002).
Testislerin renkli Doppler ile taranmasından elde edilecek sonuçların, sperm bulunmasında yol gösterici olabileceği önerilmiştir (Foresta, 1998). Bu yöntemle, kanlanmanın olduğu bölgelerden yapılan ince iğne aspirasyon biyopsileriyle ICSI’de kullanılmak üzere matür sperm elde etme başarısı önemli ölçüde artmaktadır. Ancak kesin kanıya varmak için daha geniş çalışmalara ihtiyaç vardır.
Testislerden sperm elde etme yönteminin (açık veya perkütan yolla) veya sperm kaynağı’nın (testis veya epididim) fertilizasyon ve gebelik oranları üzerine etkisi olduğunu bildiren yeterli kanıt yoktur (Jarow, 2002). Ayrıca, testislerden alınan sperm dondurulup saklandıktan sonra kullanıldığında da, taze sperme göre fertilizasyon ve gebelik üzerinde kanıtlanmış bir etki göstermemektedir. Yine de çoğu merkezde taze spermin kullanılması tercih edilmektedir. Ama zamanlama ve ekonomik nedenlerden dolayı sperm elde etme işleminin oosit toplanmasından daha önceki bir tarihte yapılarak dondurulup saklanması önerilmektedir. Bu şekilde, eğer sperm bulunamaz ise gereksiz yere IVF için hazırlanmış olacak kadında ortaya çıkabilecek hafif veya şiddetli ovarial hipersitimulasyon (%1-20) ya da oosit toplanmasına ait kanama, enfeksiyon vb. olası problemler de elimine edilmiş olunur.
Açık cerrahi yöntem kullanılarak TESE için alınan testis biyopsilerinde spermatozoa aranmasında sıklıkla mekanik ayrıştırma yöntemi kullanılmaktadır. Burada seminifer tubülilerin bazal membranları mekanik olarak parçalanarak, lümende bulunan az sayıdaki germ hücrelerinin ortama geçmeleri sağlanılır. Bu sırada spermatozoaların yanısıra yuvarlak germ hücreleri, interstisiyel hücreler ve Sertoli hücreleri de açığa çıkmaktadır. Ancak işlem sırasında bir kısım hücreler parçalanmakta ve ortama dejenere olmuş hücre artıkları, serbest nukleuslar ve rezidü doku parçaları ile toksik serbest oksijen radikalleri de çıkar (Crabbe, 1997). Diğer yandan, mekanik ayrıştırma yapıldıktan sonra bir miktar spermatozoa ve spermatidin Sertoli hücrelerinden ayrılmayarak yapışık kaldıkları ve lümene dökülmedikleri görülmektedir. Mekanik parçalamadan başka, testis dokusundan hücre elde etmede kollagen liflerini ayrıştırmak ve hücreler arasındaki bağlantıları kopararak serbestçe lümene dökülmelerini sağlamak amacıyla enzimatik ayrıştırma teknikleri de denenmiştir. Bu amaçla trypsin-Dnase, trypsin tip III ve collagenase tip I kullanılmış ve başarılı sonuçlar bildirilmiştir (Blanchard, 1991; Aslam, 1998). Nonobstrüktif azoospermili erkeklerde mekanik yöntem ile hücre bulunamayan olguların %15’inde kollajenaz tip IV enzimatik ayrıştırma yöntemi ile ICSI’de kullanılabilecek motilite ve matüritede spermatozoa elde edilebileceği ortaya konmuştur (Aydos, 2001b). Kollagenaz; dokuların ayrıştırılmasında yaygın olarak kullanılan oldukça spesifik bir proteazdır. İnsanda da testislerden sperm elde edilmesinde başarıyla kullanılmıştır (Crabbe, 1998). Fisher, bu yöntem ile insanda ilk gebelik bildirenlerdendir (Fischer, 1996). Crabbe, kollajenaz IV’ün in vivo ortamda germ hücrelerinin yer değiştirmesinde ve spermiasyon sırasında matür spermatozoaların lümene salınmasında rol oynayabileceğini ileri sürmektedir (Crabbe, 1997). Ancak, hücre süspansiyonu ortamına enzim konmasının bu hücrelerin fertilizasyon kapasitelerini nasıl etkilediğinin daha geniş serilerde araştırılması gerekir. Bu nedenle, non-obstrüktif azoospermi olgularında testis doku örneklerinin mekanik ayrıştırılması işleminin başarısız kaldığı durumlarda kollajenaz tip IV enzimi kullanılarak ayrıştırmaya devam edilmesinin, matür spermatozoa elde edilmesinde etkin bir yöntem olduğu söylenilebilir. Diğer yandan, çokmerkezli verilerin retrospektif olarak değerlendirildiği bir çalışma, mekanik ayrıştırma veya enzimatik ayrıştırma yöntemlerinin motil sperm eldesinde, fertilizasyon ve gebelik oranları üzerinde birbirlerine anlamlı bir üstünlük göstermediğini ortaya koymuştur (Baukloh,2002). İlginç bir gözlem, enzimatik yöntem ile elde edilen immotil spermatozoa ve uzamış (elongated) spermatidlerin fertilizasyon başarılarının, enzimatik yöntem kullanılan olgularda daha fazla olduğudur. Ancak, enzimatik yöntemin mekaniğe göre çok daha fazla süre aldığı da belirtilmektedir.
TESE olgularında testis dokusunun belirli bir müddet kültür ortamında bekletilmelerinin ICSI sonuçlarını olumlu etkileyeceği de önerilmektedir. Bir çok çalışma, testislerden elde edilen spermatozoaların 3 günlük kültür ortamında bekletilmelerinin, morfolojik ve fonksiyonel maturasyonlarını tamamlamaları için gerekli olduğunu ortaya koymuştur (Zhu, 1996; Tsirigotis, 1998). Bu amaçla bazı merkezlerde TESE ile elde edilen spermin 24 saat bekletildikten sonra ICSI’de kullanılmaları rutin olarak uygulanmaktadır (Elder, 1998; Levran, 2001). Böylece oosit toplanmadan bir gün önce TESE yapıldığında, spermatozoa bulunamayan olgularda kadına gereksiz girişimlerde bulunulması da önlenilebilinir.
Nonobstrüktif azoospermi olgularında spermatozoa dışında hücrelerin ICSI’de kullanılması konusu henüz tam anlamıyla standardize edilmiş değildir. Yuvarlak (round) spermatid nukleusunun hamster oositleri içine enjeksiyonu neticesi pronukleus ve singami elde edilmiş (Ogura, 1993), farelerde yuvarlak spermatidler kullanılarak canlı doğum gösterilmiştir (Ogura, 1994). İnsanda yapılan uygulamalarda ise uzayan (elongating) veya uzamış (elongated) matür spermatidlerin başarısının, yuvarlak spermatidlerden daha iyi olduğu görülmektedir (%17’ye karşılık %54) (Schoysman, 1999). Bu gözlemlere dayanılarak yapılan araştırmalar, yuvarlak spermatidlerin kültür ortamında bekletilmesini takiben kuyruk çıkartabildiklerini ortaya koymuştur (Aslam, 1998). Testis doku biyopsileri, 30oC’da, 24-48 saat süreyle, içerisinde 25mIU/ml rekombinan FSH bulunan ortamda bekletildiğinde, nukleusta kondensasyonun tamamlandığı ve nuklear protruzyon ile flagellum geliştiği izlenmiştir (Tesarik, 1998). Kültür ortamında Sertoli hücrelerinin de bulunmasının germ hücrelerinin canlılığının korunmasında gerekli olduğu bildirilmektedir (Jutte, 1985). Burada FSH’nın mayoz ile birlikte erken ve geç spermatogenezi Sertoli hücreleri aracılığı ile uyarması etken faktör olabilir.
Ancak matür olmayan spermatidler ile yapılan ICSI uygulamalarında fertilizasyon oranları son derece düşük kalmaktadır. Spermatidlerin ICSI ile fertilizasyon şansının düşük kalmasının en önemli nedeni, yuvarlak spermatid oluşumu sırasında henüz yeni başlamış olan nuklear proteinlerden histonların protaminler ile yer değiştirme işleminde yetersizlikten kaynaklanmaktadır (Meistrich, 1978). Normalde spermatid oosit içine girdiğinde, maturasyon uyarıcı faktörlerin etkisiyle proteinler arasındaki disülfit bağları kaybolarak dekondanse duruma geçer. Eksperimental çalışmalarda sperm nukleusunda dekondensasyonun başlaması için 45-60 dk. geçmesi gerektiği ortaya konmuştur (Perreault, 1987). Bu gecikme süresi normal pronukleusun gelişebilmesi için şarttır. Erken spermatid döneminde olduğu gibi, protaminlerin henüz oluşmadığı ya da yetersiz olduğu nukleuslarda dekondensasyon çok erken gelişerek prematür dekondensasyon denilen patolojik durum ortaya çıkar.
Yine de gerek yuvarlak gerekse uzamış spermatidler kullanılarak elde edilmiş sağlıklı gebelik sonuçları bildirilmiştir (Fishel, 1995; Kahraman, 1998; Tesarik, 1996). Diğer yandan, sperm prekürsörlerinin kullanımı konusunda özellikle genetik bakımdan önemli sakıncalar tartışılmaktadır (Schoysman, 1999). Bu hücrelerin canlılıkları ve normal genetik yapıya sahip olma durumları, ICSI sonrası fötusta dismorfik gelişim riski yaratabilir. Spermatid kullanılarak yapılan ICSI sonrasında bir çalışmada elde edilen 4 gebeliğin ikisinde, birisi trizomi 9 olmak üzere major malformasyonlar gözlenmiştir (Zech, 2000). Günümüzde ICSI’de immatür spermatid kullanımı henüz tam anlamıyla kabul edilmiş bir uygulama olmayıp, hastayla detaylı danışmayı gerektirmektedir.
Nonobstruktif azoospermi olgularında genetik testlerin yapılması önemlidir. Azoospermi ve şiddetli oligozoospermi genetik anomalilerle birlikte seyredebilir. İnfertil erkeklerde kromozom bozukluklarına fertil erkeklerden daha sık rastlanılmaktadır. Genetik patolojiler sperm yapımını ya da sperm taşınmasını bozarak infertiliteye neden olabilirler. Erkek infertilitesiyle ilgili en sık karşılaşılan 3 tip genetik bozukluk bilinmektedir: 1) Vaz deferenslerin konjenital yokluğu ile birlikte olan kistik fibrozis gen mutasyonları, 2) testis fonksiyonlarını etkileyen kromozom anomalileri, ve 3) izole spermatogenez bozukluğu yaratan Y kromozomu mikrodelesyonları.
Vaz deferenslerin bilateral gelişmemesi ile CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) geni mutasyonları arasında kuvvetli bir ilişki bulunmaktadır (Anguiano, 1992; Chillon, 1995). Kistik fibrozis otozomal geçiş gösteren fatal bir hastalıktır. Klinik olarak kistik fibrozis hastalığı bulunan erkeklerin hemen tamamında her iki vaz deferensin konjenital yokluğu söz konusu olup, vaz deferensleri gelişmemiş erkeklerin 2/3’ünde de kistik fibrozisin diğer belirtileri bulunmamakla birlikte CFTR gen mutasyonları saptanmaktadır. Bu nedenle, eğer bir erkekte doğuştan iki taraflı vaz deferensler gelişmemişlerse CFTR geninde bir defekt bulunabileceği akılda tutulmalıdır. Üremeye yardımcı teknikler uygulanmadan önce böyle erkeklerde eşleri ile birlikte CFTR gen mutasyonu araştırılması önerilir (Weidner, 2002). Eğer kadının da taşıyıcı olduğu ortaya konursa çocuğa geçiş konusunda detaylı genetik bilgilendirme şarttır. Her ne kadar tek taraflı vaz deferens yokluğu farklı genetik nedene sahipse de, böyle erkeklerin bazılarının da kistik fibrozis mutasyonu taşıdıkları bildirilmiştir. Bu nedenle, tek taraflı vaz deferens yokluğu saptanan erkeklerinde diğerleri gibi genetik danışmanlığı uygun görülmektedir (Oates, 1994; Weidner, 2002).
Azoospermili erkeklerin %10-15’inde karyotip analizlerinde kromozom defektleri bulunmaktadır (De Braekeleer, 1991). Bu oran normal erkeklerde %1’den azdır (Pryor, 1997). En sık rastlanılan seks kromozom anöploidisi Klinefelter sendromu olup, infertil erkeklerdeki kromozom bozukluklarının yaklaşık üçte ikisini oluşturur. Böyle erkeklerde 47XXY spermatozoa yapma riski yüksektir. IVF/ICSI uygulamalarında preimplantasyon genetik tanı veya amniyosentez ve karyotiplendirme yapılması önerilir ve Klinefelter karyotipi taşıyan embriyolar implante edilmemelidirler (Tournaye, 1996; Weidner, 2002). Otozomal kromozomların inversiyon veya translokasyon gibi yapısal anomalileri de infertil erkeklerde genel populasyona göre daha sık görülmektedir. Otozomal karyotip anomalisi saptanan çiftlerde de genetik bilgilendirme yapılmalıdır. X-bağımlı resesif geçiş gösteren kromozom bozuklukları erkekte belirti verip, kız çocukları tarafından nakledilirler. Bunlardan infertiliteyle birlikte görülenleri Kallman sendromu ve Reifenstein sendromu (androjen duyarsızlığı)’dur. Çoğu X-bağımlı kromozom bozuklukları fenotipik belirti verirler ama fertiliteyi etkilemezler. Erkekte belirgin bir karyotip bozukluğu bulunması hem düşük riskini hem de kromozomal anomalili ve konjenital defektli çocuk doğurma riskini artırır (Jarow, 2002).
Azoopsermide Y kromozom mikrodelesyonları bulunma sıklığı ise %10-15’dir (Pryor, 1997). Karyotip analizi ile tanınamayacak kadar küçük bir alanı kapladıkları için PCR (polymerase chain reaction) yöntemi kullanılarak Y kromozomunun boylu boyunca taranmasıyla saptanabilirler. Ancak bu testler henüz tam anlamıyla standardize edilmiş değildirler. Azoospermiye neden olan delesyonların en sık görüldüğü bölge Y kromozomunun uzun kolu üzerinde lokalizedir (Yq11). Y kromozomu üzerinde delesyonun bulunduğu yer spermatogenezi etkilemesi bakımından önemlidir. Eğer Y kromozomunda delesyona uğrayan genler AZFc bölgesinde lokalize olmuşlarsa, sayısı ciddi miktarda azalmış olsa da ejakulatta sperm çıkmaya devam edebilir. Bu grup hastaların bir kısmında ise azoospermi bulunmakla birlikte, testislerinde TESE ile sperm bulunarak ICSI’de kullanılabilir. AZFb bölgesinin tamamını içeren delesyon olgularının prognozu oldukça kötüdür, çünkü çok sayıda biyopsi alınsa bile TESE ile sperm elde etme şansları oldukça azdır (Brandell, 1998). AZFa bölge delesyonlarında da TESE ile sperm bulma şansı çok düşüktür (Krausz, 2000).
Y kromozomunda mikrodelesyon bulunan erkekler bu anomaliyi erkek çocuklarına nakledebilirler ve neticede bu çocuklar da infertil olabilirler (Kent-First, 1996). Her ne kadar Y kromozom mikrodelesyonlarının başka sağlık problemlerine yol açmadıkları düşünülse de, böyle genetik defektli erkeklerin çocuklarının fenotipleriyle ilgili nadir bildiriler de sunulmuştur. Y kromozom testinde delesyon bulunmaması genetik bir defektin de bulunmayacağı anlamına gelmez. Çünkü Y kromozomu ya da diğer kromozomlar üzerinde spermatogenez için gerekli henüz bilinmeyen başka gen dizeleri de bulunabilir. Aksine, Y kromozom mikrodelesyonu içeren erkekler de fertil olup çocuk sahibi olabilirler (Pryor, 1997; Kent-First, 1999). Nonobstrüktif azoospermi saptanan erkekler kromozom bozukluğu ya da Y kromozom mikrodelesyonu taşıyabilecekleri konusunda uyarılmalıdırlar. Bu nedenle, nonobstrüktif azoospermi bulunan erkeklerde ICSI yapmadan önce karyotip ve Y kromozomu mikrodelesyon testleri istenmesi önerilir.
Sonuç olarak, nonobstrüktif azoospermi bulunan erkekler azoospermi ile birlikte görülebilecek genetik problemlerin potansiyel riskleri konusunda mutlaka bilgilendirilmelidirler. Nonobstrüktif azoopsermi olgularında kendi spermleri ICSI’de kullanılmadan önce karyotiplendirme, Y kromozom analizi ve genetik danışmanlığın yapılması gerekir. Genetik bir anormallikten şüphelenilen ya da testler ile saptanılan erkek veya kadında genetik danışmanlık verilmesi çok önemlidir (Johnson, 1998).
Nonobstrüktif azoospermi olgularında TESE sırasında testis dokusunda matür sperm bulunup bulunmayacağını önceden tahmin etmek amacıyla değişik testler önerilmektedir. Bu amaçla testis dokusunda telomeraz aktivitesi ölçümü kullanılmıştır. Hücre bölünmesinde sürekli olarak kısalan, kromozomların ucundaki telomer sekanslarının yeniden yapılandırılabilmesi için telomeraz aktivitesine gereksinim vardır. Hücresel ölümsüzlük mekanizmasının altında da sürekli telomeraz varlığı mekanizması öngörülmektedir (Herbert, 1999). Testiste telomeraz aktivitesinin bulunduğu ve bunun sadece germ hücrelerine ait olduğu gösterilmiştir. Fareler ve ratların yanı sıra insanda da telomeraz aktivitesi varlığı değişik çalışmalarda bildirilmektedir (Wright, 1996; Yamamoto, 1999). Spermatogenetik hücrelerde bu enzimin aktivitesi mayotik ve post-mayotik süreç boyunca azalır. En yüksek seviyeleri spermatogonia ve primer spermatositlerde tespit edilirken, yuvarlak spermatidlerde en az bulunur. Testiküler ve epididimal spermatozoalarda hiç gösterilmemiştir (Prowse, 1993; Eisenhauer, 1997).
Ancak, germ hücrelerinin hangi basamağında telomeraz aktivitesinin daha fazla olacağı henüz kesinlik kazanmamıştır. Daha detaylı yapılan çalışmalarda, obstrüktif azoospermi ile maturasyon duraklaması olan erkeklerin testis biyopsi örneklerinde telomeraz aktiviteleri bakımından bir fark bulunamamıştır (Fujisawa, 1998). Normal spermatogenez, hipospermatogenez ve maturasyon duraklamalı erkeklerde ise telomeraz aktivitesi mevcut olmakla birlikte, pür SCO sendromlu erkeklerde bu enzimin aktivitesine rastlanılmaz. Testis dokusunda birim ağırlığı başına telomeraz aktiviteleri ile spermatogenez kalitesinin karşılaştırıldığı daha duyarlı kantitatif deneylerde, haploid germ hücreleri (spermatozoa veya spermatidler) varsa telomeraz aktivitesinin de artacağı bildirilmektedir (Yamamoto, 1999).
Yukarıdaki bulgular değerlendirildiğinde, SCO sendromu olgularında hiç telomeraz aktivitesinin bulunmadığı, bu aktivitenin varlığında ise herhangi bir seviyede germ hücresinin bulunabileceği düşünülerek, obstrüktif olmayan azoospermi olgularında gerçek SCO sendromunun tanınmasında bu enzimin bir markır olarak kullanılabileceği önerilmektedir (Anniballo, 2000). Tanısal amaçlı biyopsilerde telomeraz bulunması germ hücrelerinin varlığı için bir kanıt olarak önerilebilir. Kantitatif telomeraz testleri ise haploid hücre varlığı için bir göstergedir. Eğer tespit edilirse haploid germ hücrelerinin bulunduğu miks SCO sendromu tanısı yönünde uyarmalıdır. Bu durumda miks SCO sendromlu olgular ICSI programına alınabilirler. Haploid hücre odaklarının bulunmaması ise pür SCO sendromuna işaret eder ve bunlarda ICSI için uygun germ hücresi bulunamıyacağı düşünülebilir.
Nonobstrüktif azoospermi olgularında testis dokusunda sperm varlığını araştırmada bir diğer önerilen analiz ise Sertoli hücrelerinde lipid granüllerinin bulunmasıdır (Anniballo, 2000). Normal testislerde Sertoli hücreleri sitoplazmalarında bol miktarda lipid granülleri bulundururlar. Bunlar spermiasyon sırasında spermatidlerin sitoplazmik artıklarından kaynaklanmaktadır. Sertoli hücrelerinin dejenere germ hücrelerini absorbe etmeleri durumunda sitoplazmalarında bol miktarda lipid granülleri birikecektir. Pür SCO sendromu olgularında ise Sertoli hücreleri germ hücreleri ile hiç temas etmedikleri için, sadece çok az miktarda lipid ve glikojen içerirler. Bu nedenle, sitoplazmik lipidlerin azalmış olması, sitoplazmik artıklarla ilgili herhangi bir metabolik faaliyetin gerçekleşmemiş olduğunu ve dolayısıyla spermatidin de bulunmadığını gösterir.
Ejakulatta yuvarlak (round) spermatid gösterilmesi, TESE’de matür spermatozoa bulunabileceğinin bir göstergesi olarak önerilmiştir. Amer, ejakulatın May-Grünwald-Giemsa (MGG) ile boyalı preparatlarında yuvarlak spermatid bulunan olguların önemli bir kısmında testislerinden spermatozoa elde edilebileceğini göstermiştir (Amer, 2001). TESE ile spermatozoa bulunan olguların %83’ünde ejakulatlarında yuvarlak spermatid ayırt edilmektedir. Buna dayanarak, ejakulatın boyalı preparatlarında spermatid aranmasının TESE sonucunu tahmin etmede yüksek duyarlılıkta, ekonomik ve invaziv olmayan bir yöntem olduğunu ileri sürmektedir.
Non-obstrüktif azoospermi olgularının ejakulatında, Sertoli hücreleri ile olan bağlantılarını erken kaybederek lümene dökülmüş immatür germ hücrelerine sıklıkla rastlanılmaktadır. Ejakulatta farklı evrelerdeki germ hücrelerinin miktar ve canlılıklarının ölçülmesinin, invaziv tanısal yöntemlere gerek kalmaksızın testis fonksiyonu konusunda bilgi verebileceği önerilmektedir. Germ hücrelerinin ejakulatta bulunan diğer yuvarlak hücrelerden ayırt edilmesi her zaman kolay olmayabilir. Ancak, ejakulatta spermatid varlığının gözlenmesinin TESE sırasında testis dokusundan spermatozoa elde edilebileceğini önceden bildiren bir markır olabileceği diğer araştırıcılar tarafından da savunulmaktadır (Ezeh, 1998). Testis dokusunda spermatogenezin fokal odaklar halinde bulunabileceği azoospermi olgularında, ejakulatta spermatid bulunmuş olsa bile testis biyopsilerinde spermatid ya da spermatozoaya rastlanılamıyabileceği de unutulmamalıdır.
Sonuç olarak, üremeye yardımcı tekniklerin ve özellikle ICSI’nin tedavi alanına girmesiyle erkek faktörü infertilite olgularının önemli bir kısmı artık çocuk sahibi olabilmektedirler. Tıptaki bu büyük ilerlemeye rağmen yine de henüz tam anlamıyla çözümlenmemiş olan nonobstrüktif azoospermi ise artık androloji‘nin önemli bir ilgi alanı haline gelmiştir. Nonobstrüktif azoospermi konusu, gerek cerrahi yönü gerekse laboratuvar işlemleri ve genetik sonuçları bakımından üzerinde çok yönlü çalışmaların yapılmasını bekleyen, geniş bir araştırma konusu olma özelliği taşımaktadır. Bunun devamı nuklear manipulasyonlar ve somatik hücre klonlama çalışmalarıdır. Ancak bütün veriler spermin sadece genetik materyalinin oositin fertilizasyonunda yeterli olmadığına, işlemi başlatacak başka faktörlerin varlığına ve bunların sağlıklı fonksiyon görmelerinin gerekliliğine işaret etmektedir. Bu sonuçlar spermin daha in vivo ortamdayken iyileştirilmesi veya uyarılması ile mümkün olacağı kanısını vermektedir. Spermin değil öncelikle erkeğin tedavi edilmesi hiç kuşkusuz en güvenilir ve pratik bir yaklaşımdır.
Kaynaklar
Allenby G, Foster PM, Sharpe RM: Evaluation of changes in the secretion of immunoactive inhibin by adult rat seminiferous tubules in vitro as an indicator of early toxicant action on spermatogenesis. Fundam Appl Toxicol 1991; 16: 710-714.
Amer M, Haggar SE, Moustafa T, Abd El-Naser T, Zohdy W. Testicular sperm extraction: impact of testicular histology on outcome, number of biopsies to be performed and optimal time for repetition. Hum Reprod. 1999; 14: 3030-4.
Amer M, Abd Elnasser T, El Haggar S, et al: May-Grünwald-Giemsa stain for detection of spermatogenic cells in the ejaculate: a simple predictive parameter for successful testicular sperm retrieval Hum. Reprod 2001; 16: 1427-1432.
Anguiano A, Oates RD, Amos JA, Dean M, Gerrard B, Stewart C, Maher TA, White MB, Milunsky A. Congenital bilateral absence of the vas deferens. A primarily genital form of cystic fibrosis. JAMA. 1992; 267: 1794-7.
Anniballo R, Ubaldi F, Cobellis L, Sorrentino M, Rienzi L, Greco E, Tesarik J: Criteria predicting the absence of spermatozoa in the Sertoli cell-only syndrome can be used to improve success rates of sperm retrieval. Review. Hum Reprod 2000; 15: 2269-2275.
Aslam I, Fishel S. Short-term in-vitro culture and cryopreservation of spermatogenic cells used for human in-vitro conception. Hum Reprod. 1998;3: 634-8.
Aslam I, Robins A, Dowel K, Fishel S: Isolation, purification and assessment of viability of spermatogenic cells from testicular biopsies of azoospermic men. Hum Reprod 1998; 13: 639-643.
Aydos K: Testiküler sperm ekstraksiyonu ile spermatozoa elde etmede mikrocerrahi yöntem ve çoklu biyopsi alma yönteminin karşılaştırılması. Üroloji Bülteni 2001a; 12: 181-184.
Aydos K: Nonobstrüktif azoospermi olgularında mikroskopik TESE: mekanik ve enzimatik ayrıştırma yöntemlerinin karşılaştırılması. Klinik Bilimler Cerrahi Dergisi 2001b; 7: 636-640.
Aydos K: İn vitro sperm maturasyonu. Klinik Androloji. Özdiler E, Aydos K (ed), Ankara Üniversitesi Basımevi, Ankara, 2000.
Ballesca JL, Balasch J, Calafell JM, Alvarez R, Fabregues F, de Osaba MJ, Ascaso C, Vanrell JA. Serum inhibin B determination is predictive of successful testicular sperm extraction in men with non-obstructive azoospermia. Hum Reprod. 2000; 15: 1734-8.
Baukloh V. Retrospective multicentre study on mechanical and enzymatic preparation of fresh and cryopreserved testicular biopsies Hum. Reprod. 2002; 17: 1788-1794.
Blanchard Y, Lavault MT, Quernee D, et al: Preparation of spermatogenic cell populations at specific stages of differentiation in the human. Mol Reprod Dev 1991; 30: 275-279.
Brandell RA, Mielnik A, Liotta D, Ye Z, Veeck LL, Palermo GD, Schlegel PN. AZFb deletions predict the absence of spermatozoa with testicular sperm extraction: preliminary report of a prognostic genetic test. Hum Reprod. 1998; 13: 2812-5.
Brugo-Olmedo S, De Vincentiis S, Calamera JC, Urrutia F, Nodar F, Acosta AA. Serum inhibin B may be a reliable marker of the presence of testicular spermatozoa in patients with nonobstructive azoospermia. Fertil Steril. 2001; 76: 1124-9.
Carlsen E, Olsson C, Petersen JH, Andersson AM, Skakkebaek NE: Diurnal rhythim in serum levels of inhibin B in normal men: relation to testicular steroids and gonadotropins. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 1664-1669.
Chillon M, Casals T, Mercier B, Bassas L, Lissens W, Silber S, Romey MC, Ruiz-Romero J, Verlingue C, Claustres M, et al. Mutations in the cystic fibrosis gene in patients with congenital absence of the vas deferens. N Engl J Med. 1995; 332: 1475-80.
Crabbe E, Verheyen G, Tournaye H, Van Steirteghem A: The use of enzymatic procedures to recover testicular germ cells. Hum Reprod 1997; 12: 1682-1686.
Crabbe E, Verheyen G, Silber S,et al: Enzymatic digestion of testicular tissue may rescue the intracytoplasmic sperm injection cycle in some patients with non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 1998; 13: 2791-2795.
de Braekeleer M, Dao TN. Cytogenetic studies in male infertility: a review. Hum Reprod. 1991; 6: 245-50.
de Geyter C, De Geyter M, Meschede D, Behre HM: Assisted fertilization. In: Andrology Male Reproductive Health and Dysfunction. E Nieschlag, HM Behre (eds), p. 337-366, Springer-Verlag, Berlin, 2000.
de Kretser DM, Burger HG, Hudson B. The relationship between germinal cells and serum FSH levels in males with infertility. J Clin Endocrinol Metab. 1974; 38: 787-93.
Devroey, P., Liu, J., Nagy, Z. et al: Pregnancies after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection in non obstructive azoospermia. Hum. Reprod 1995; 10: 1457-1461.
Eckardstein S, Simoni M, Bergmann M, Weinbauer GF, Gassner P, Schepers AG, Nieschlag E: Serum inhibin B in combination with serum follicle-stimulating hormone (FSH) is a more sensitive marker than serum FSH alone for impaired spermatogenesis in men, but cannot predict the presence of sperm in testicular tissue samples. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 2496-2501.
Eisenhauer KM, Gerstein RM, Chiu CP, Conti M, Hsueh AJ: Telomerase activity in female and male rat germ cells undergoing meiosis and in early embryos. Biol Reprod 1997; 56: 1120-1125.
Elder K, Elliot T: The use of testicular and epididymal sperm in IVF: culture of testicular sperm. World wide conferences on reproductive biology. P: 46-49, Ladybrook pub, MAD print and delivery, Morley, West Australia 6062, 1998.
Ezeh UIO, Moore HDM, Cooke ID: A prospective study of multiple needle biopsies versus a single open biopsy for testicular sperm extraction in men with non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 1998; 13: 3075-3079.
Fischer R, Baukloh V, Naether OGJ, et al: Pregnancy after intracytoplasmic sperm injection of spermatozoa extracted from frozen-thawed testicular biopsy. Hum Reprod 1996; 11: 2197-2201.
Fishel S, Green S, Bishop M, Thornton S, Hunter A, Fleming S, al-Hassan S. Pregnancy after intracytoplasmic injection of spermatid. Lancet. 1995; 345: 1641-2.
Foresta C, Garolla A, Bettella A, Ferlin A, Rossato M, Candiani F. Doppler ultrasound of the testis in azoospermic subjects as a parameter of testicular function. Hum Reprod. 1998; 13: 3090-3.
Foresta C, Bettella A, Petraglia F, Pistorello M, Luisi S, Rossato M: Inhibin B levels in azoospermic subjects with cytologically characterized testicular pathology. Clin Endocrinol (Oxf) 1999; 50: 695-699.
Friedler S, Raziel A, Schachter M, Strassburger D, Bern O, Ron-El R. Outcome of first and repeated testicular sperm extraction and ICSI in patients with non-obstructive azoospermia. Hum Reprod. 2002; 17: 2356-61.
Fujisawa M, Tanaka H, Tatsumi N, Okada H, Arakawa S, Kamidono S: Telomerase activity in the testis of infertile patients with selected causes. Hum Reprod 1998; 13: 1476-1481.
Garem YF, Arini AF, Beheiry AH, Zeid SA, Comhaire FH. Possible relationship between seminal plasma inhibin B and spermatogenesis in patients with azoospermia. J Androl. 2002; 23: 825-9.
Guthauser B, Bailly M, Bergere M, Wainer R, Ville Y, Selva J. Successful pregnancy and delivery after testicular sperm extraction despite an undetectable concentration of serum inhibin B in a patient with nonobstructive azoospermia. Fertil Steril. 2002; 77: 1077-8.
Herbert B, Pitts AE, Baker SI, Hamilton SE, Wright WE, Shay JW, Corey DR: Inhibition of human telomerase in immortal human cells leads to progressive telomere shortening and cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96: 14276-14281.
Jarow JP, Sharlip ID, Belker AM, Lipshultz LI, Sigman M, Thomas AJ, Schlegel PN, Howards SS, Nehra A, Damewood MD, Overstreet JW, Sadovsky R. Best practice policies for male infertility. J Urol. 167: 2138-44, 2002.
Jarow , J. P., Espeland , M. A. And Lipshultz , L. I.: Evaluation of the azoospermic patient.J Urol 1989; 142: 62-67.
Jezek D, Knuth UA, Schulze W: Successful testicular sperm extraction (TESE) in spite of high serum follicle stimulating hormone and azoospermia: correlation between testicular morphology, TESE results, semen analysis and serum hormone values in 103 infertile men. Hum Reprod 1998; 13: 1230-1235.
Johnson MD. Genetic risks of intracytoplasmic sperm injection in the treatment of male infertility: recommendations for genetic counseling and screening. Fertil Steril. 1998; 70: 397-411.
Jutte N, Jansen JR, Grootegoed J, et al: Regulation of survival of rat pachytene spermatocytes by lactate supply from Sertoli cells. J Reprod Fertil 1985; 62: 399-403.
Kahraman S, Polat G, Samli M, Sozen E, Ozgun OD, Dirican K, Ozbicer T. Multiple pregnancies obtained by testicular spermatid injection in combination with intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. 1998; 13: 104-10.
Kent-First MG, Kol S, Muallem A, Ofir R, Manor D, Blazer S, First N, Itskovitz-Eldor J. The incidence and possible relevance of Y-linked microdeletions in babies born after intracytoplasmic sperm injection and their infertile fathers. Mol Hum Reprod. 1996; 2: 943-50.
Kent-First M, Muallem A, Shultz J, Pryor J, Roberts K, Nolten W, Meisner L, Chandley A, Gouchy G, Jorgensen L, Havighurst T, Grosch J. Defining regions of the Y-chromosome responsible for male infertility and identification of a fourth AZF region (AZFd) by Y-chromosome microdeletion detection. Mol Reprod Dev. 1999 ; 53: 27-41.
Krausz C, Quintana-Murci L, McElreavey K. Prognostic value of Y deletion analysis: what is the clinical prognostic value of Y chromosome microdeletion analysis? Hum Reprod. 2000; 15: 1431-4.
Levran D, Ginath S, Farhi J, Nahum H, Glezerman M, Weissman A. Timing of testicular sperm retrieval procedures and in vitro fertilization-intracytoplasmic sperm injection outcome. Fertil Steril. 2001; 76: 380-3.
Meistrich M, Brock WA, Grimes SR, et al: Nuclear protein transitions during spermatogenesis. Fed Proc 1978; 37: 2522-2526.
Oates RD, Amos JA. The genetic basis of congenital bilateral absence of the vas deferens and cystic fibrosis. J Androl. 1994; 15: 1-8.
Ogura A, Yanagimachi R. Round spermatid nuclei injected into hamster oocytes from pronuclei and participate in syngamy. Biol Reprod. 1993; 48: 219-25.
Ogura A, Matsuda J, Yanagimachi R. Birth of normal young after electrofusion of mouse oocytes with round spermatids. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91: 7460-2.
Perreault SD, Naish SJ, Zirkin BR: The timing of hamster sperm nuclear decondensation and male pronucleus formation is related to sperm nuclear disulfide bond content. Biol Reprod 1987; 36: 239-243.
Pineau C, Sharpe RM, Saunders PT, Gerard N, Jegou B: Regulation of Sertoli cell inhibin production and of inhibin alpha-subunit mRNA levels by specific germ cell types.Mol Cell Endocrinol 1990; 30: 13-16.
Prowse KR, Avilion AA, Greider CW: Identification of a nonprocessive telomerase activity from mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 15: 1493-1497.
Pryor JL, Kent-First M, Muallem A, Van Bergen AH, Nolten WE, Meisner L, Roberts KP. Microdeletions in the Y chromosome of infertile men. N Engl J Med. 19972; 336: 534-9.
Schlegel PN: Testicular sperm extraction: microdissection improves sperm yield with minimal tissue excision. Hum Reprod 1999a; 14: 131-134.
Schlegel PN: Sperm retrieval techniques for assisted reproduction. Inf Reprod Med Clin North Am 1999b; 10: 539-553.
Sharpe RM: Intratesticular factors controlling testicular function. Biol Reprod 1994; 30: 29-33.
Schoysman R, Vanderzwalmen P, Bertin G, Nijs M, Van Damme B. Oocyte insemination with spermatozoa precursors. Curr Opin Urol. 1999; 9: 541-5.
Tesarik J, Rolet F, Brami C, Sedbon E, Thorel J, Tibi C, Thebault A. Spermatid injection into human oocytes. II. Clinical application in the treatment of infertility due to non-obstructive azoospermia. Hum Reprod. 1996; 11: 780-3.
Tesarik J, Greco E, Rienzi L, Ubaldi F, Guido M, Cohen-Bacrie P, Mendoza C: Differentiation of spermatogenic cells during in-vitro culture of testicular biopsy samples from patients with obstructive azoospermia: effect of recombinant follicle stimulating hormone. Hum Reprod 1998; 13: 2772-2776.
Tournaye H, Staessen C, Liebaers I, Van Assche E, Devroey P, Bonduelle M, Van Steirteghem A. Testicular sperm recovery in nine 47,XXY Klinefelter patients. Hum Reprod. 1996; 11: 1644-9.
Tournaye H, Camus M, Vandervorst M, et al: Sperm retrieval for ICSI. Int J Androl 1997; 20: 69-72.
Tsirigotis M: In vitro maturation of human testicular spermatozoa. In: Treatment of infertility: new frontiers. M Filicori, C Flamigni (eds), Commnications Media for Education, Inc., New Jersey, 1998.
von Eckardstein S, Simoni M, Bergmann M, Weinbauer GF, Gassner P, Schepers AG, Nieschlag E: Serum inhibin B in combination with serum follicle-stimulating hormone (FSH) is a more sensitive marker than serum FSH alone for impaired spermatogenesis in men, but cannot predict the presence of sperm in testicular tissue samples. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 2496-2500.
Weidner W, Colpi GM, Hargreave TB, Pappgk, Pomerol JM, the EAU working group on male infertility: EAU guidelines on male infertility. Eur Urol 2002; 42: 313-22.
WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction.New York:Cambridge University Press, 1999.
Willott , G. M.: Frequency of azoospermia.Forensic Sci Int 1982; 20: 9-13.
Wright WE, Piatyszek MA, Rainey WE, Byrd W, Shay JW: Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Dev Genet 1996; 18: 173-177.
Yamamoto Y, Sofikitis N, Mio Y, Miyagawa I: Highly sensitive quantitative telomerase assay of diagnostic testicular biopsy material predicts the presence of haploid spermatogenic cells in therapeutic testicular biopsy in men with Sertoli cell-only syndrome. Hum Reprod 1999; 14: 3041-3046.
Zech H, Vanderzwalmen P, Prapas Y, Lejeune B, Duba E, Schoysman R. Congenital malformations after intracytoplasmic injection of spermatids. Hum Reprod. 2000; 15: 969-71.
Zhu J, Tsirigotis M, Pelekanos M, Craft I. In-vitro maturation of human testicular spermatozoa. Hum Reprod. 1996; 11: 231-2.
