ICSI olarak bilinen tüp bebek dendiğinde, mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak tek bir sperm hücresinin yumurta içine verilmesi anlaşılır. İlk kez 1992 yılında Brüksel Vrije Üniversitesi’nde Palermo tarafından uygulamaya başlanmıştır. Bu yöntemle çiftlerin yaklaşık yarısı çocuk sahibi olabilir. Ancak geri kalan yarısında ise ne yazık ki sonuç alınamamaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar, bu olgularda sperme ait faktörlerin rol oynayabileceğini ortaya koymuştur (1-5).
Fertilizasyon yani döllenme, spermin içindeki genetik materyali yumurtaya taşımasıyla gerçekleşir. Spermin genetik malzemesi kromozomlar olup, DNA adı verilen bir çift zincirden oluşmuşlardır. Bu zincir üzerinde dizilen genlerimiz, yumurtadaki genlerle eşleşerek embriyoyu meydana getirir ve bu da 9 ay sonra dünyaya gelecek olan çocuğumuza doğru oldukça karışık bir gelişim süreci içine girer. İşte, sağlıklı bir gebeliğin olabilmesi ve başarılı bir doğumla sonuçlanabilmesi, ancak sağlam genetik malzemelerin varlığına bağlıdır.
Erkekte üretilen sperm hücreleri testisi terk ettikten sonra yaklaşık 5 metre yol alır. Bu sırada da dış ortam ile sürekli etkileşim içinde kalırlar. Üreme hücreleri aslında dış ortama son derece duyarlıdır. Bunlar arasında sigara başta olmak üzere çok sayıda toksik ürün spermin işlev görmesini engelleyebilir. Kesinleşmiş olmamakla birlikte elektromanyetik dalgaların da zararlı olabileceği bildirilmektedir. Nedenini bilmediğimiz başka yapısal faktörler de söz konusu olabilir. Spermdeki bozulmanın en önemli nedeni, DNA zincirindeki hasarlardır. Hücre metabolizması sırasında normalde de açığa çıkan ama sperm için zararlı olan bir takım oksijen moleküllerinin miktarı arttığı zaman, “oksidatif stres” olarak bilinen bir olay meydana gelerek, neticesinde DNA kırıklarına yol açar. Bu da sağlıklı embriyo gelişimini bozabilir. Aslında vücudumuz DNA hasarlarına karşı bazı tedbirler de almıştır. Örneğin, hücre çoğalması sırasında kromozomlar eşleşirken, hasarlı kısımlar onarılabilir. Ayrıca vücudumuzda, spermlerin DNA’sının böyle toksik oksidatif stres ürünlerinden korunmasını sağlayan çok sayıda madde de yapılır.
Klasik semen tahlilinde sperm parametreleri bozuk olan erkekler için tüp bebek, başarısı kabul edilmiş bir tedavi şeklidir. Tüp bebek yapılırken hareketli ve düzgün şekilli spermlerin seçilmesi çok önemlidir. Oysa seçilen spermler normal şekilde olsa bile, içlerindeki DNA zincirleri hasarlı olabilir (6). Ne yazık ki klasik sperm incelemeleri DNA içeriği hasarlı olmayan hücrelerin seçiminde yetersiz kalmaktadır. Bilimsel veriler, tüp bebek başarısızlıklarında erkeğe ait faktörlerin söz konusu olabileceğini ortaya koymuştur. Özellikle sperm çekirdeğindeki genetik materyal bozuklukları gerek döllenmeyi gerekse sağlıklı embriyo gelişimini engelleyebilir, hatta düşüklere yol açabilir. Daha da önemlisi, henüz kanıtlanmış olmasa da, doğacak bebeğin sağlığını bozabileceği de ileri sürülmüştür (7,8).
Diğer yandan, sperm DNA hasarlarındaki artışın doğal yolla gebe kalma şansını azaltacağı yönünde elimizde fazlaca veri bulunsa da, tüp bebek başarısıyla ilişkisi tartışmalıdır. Bazı araştırıcılar DNA hasarlarına ait olumsuz bir etki bildirmezken (10), diğerleri döllenme ve gebelik başarısı ile anlamlı bir ilişkinin bulunabileceğine dikkat çekmektedir. Burada sorun, tüp bebek yapılırken yalnızca sperm hareketinin ve şeklinin normal olmasına dikkat edilmesidir. Oysa seçilen sperm hücresinin DNA içeriğinin sağlamlılığı da başarılı bir sonuç alınmasında önemli olabilir (9).
Aslında DNA’sı hasarlı spermler de, sağlıklı spermler kadar yumurtayı dölleyebilir. Ama döllenmenin üçüncü gününde, spermden gelen ve erkeğe ait genetik materyalin aktive olması gerekir. İşte, eğer bu aktivasyonu sağlayan genler bozuk ise, embriyo da gelişemeyecektir (11). Dolayısıyla, tüp bebek yapılırken farkında olmadan DNA’sı hasarlı spermin seçilmesi, bir yandan embriyonun normal gelişimini bozabilecek diğer da yandan doğacak çocuğun sağlığını etkileyebilecektir. Bunu destekleyen çok sayıda hayvan deneyi yapılmıştır.
Araştırmalar, ne kadar detaylı araştırılırsa araştırılsın tamamen normal şekle sahip spermlerin bile yaklaşık %15’inde DNA içeriklerinin hasarlı olabileceğine dikkat çekmektedir. DNA’sı bozuk sperm sayısı arttıkça, embriyonun kalitesi de bozulur. Gerçekten de, eğer rutin analizde spermlerin %17’den azı DNA hasarlıysa, bunların tüp bebek ile gebe kalma şansları da 3,5 kez artar. Hasarlı DNA içeren sperm sayısı arttıkça, gebelik şansı da yarı yarıya düşer. Ancak şunu da unutmamalı ki, embriyo kalitesinin belirlenmesinde kadının yaşı ve fertilize olan yumurta sayısı da dikkate alınmalıdır (9).
Başka araştırıcılar da; hasarlı ya da kırık DNA taşıyan sperm sayısındaki artışın sperm parametrelerindeki bozulma ile anlamlı bir ilişki gösterdiğini, infertil erkeklerde (%25-%27) fertillere göre (%10-%13) daha yüksek bulunduğunu bildirmiştir (12). Elimizdeki sonuçlar, fertilite şansının belirlenmesinde sperm DNA’sının sağlamlılığının değerlendirilmesinin standart sperm analizinden daha faydalı olduğunu düşündürür. Gerçekten de, izah edilemeyen infertilite olgularında semen analizi normal bile olsa, hasarlı DNA taşıyan sperm sayıları anlamlı ölçüde artmaktadır (13). Veriler, tubal obstrüksiyon gibi kadın faktörü bulunan infertilite olgularında erkek eşlerinin önemli bir kısmında DNA hasarlı sperm oranının arttığını ortaya koymaktadır (14). Bu sonuçlar, şiddetli kadın faktörü olgularında aslında erkeğe ait faktörlerin de eşlik edebileceğini göstermesi bakımından önemlidir.
DNA hasarlarından korunmak için, buna neden olabilecek etkenlerden kaçınmak gerekir. Bunun başında da sigaranın bırakılması gelir. Elektromanyetik dalga kaynaklarından da mümkün olduğunca uzak durulmalıdır (30). Varikoselde DNA’da bozulma yapabilir. Bu nedenle, eğer muayene sırasında belirgin bir varikosel bulunursa ameliyatla düzeltilmelidir (31). Hasarlı DNA içeren sperm oranı artmışsa, gonadotropin hormonlarının (HMG, FSH) kullanılması da, tüp bebek başarısını artırabilir (15-25). Her ne kadar kanıtlanmamış olsa da (28), çok sayıda çalışma bu yönde dikkat çeker. Gerçekten de, çocuk sahibi olamayan erkeklerde FSH tedavisi yapılmasının sperm genetik yapısındaki bozuklukları azaltıcı etkisi bulunduğu ultrastrüktürel çalışmalarda ortaya konmuştur (20). Erkeğin FSH hormonu kullanmasının fertilizasyon oranlarını artırıcı etkisi spermin subsellüler yapısındaki düzelmeye bağlanmaktadır. Çok sayıda klinik çalışmada yeterli süre hormon tedavisi verilmesinin DNA hasarlarını azaltacağı gösterilmiştir.
New York Cornell Üniversitesinden P. Schlegel ve arkadaşları, sperm parametreleri ileri derecede bozulmuş erkeklere tüp bebek yapıldığında gebelik oranlarının düştüğünü, oysa böyle kötü spermli olgularda testislerden alınan spermlerin kullanılmasıyla başarının arttığını bildirmiştir. Sperm değerleri bozuk erkeklerde ejakulattan alınan spermlerle transfer başına uygulamaların %41’inde klinik gebelik sağlanırken, aynı erkeklerde testislerden alınan spermler kullanıldığında bu oran %64’e çıkmıştır. Araştırıcılar; bu tip olgularda tüp bebek sırasında TESE ile testislerden elde edilecek spermlerin kullanılmasını önermektedirler (26).
Benzer şekilde, İtalya ve Fransa’dan bilim adamlarının gerçekleştirdikleri çalışmalarda da, tüp bebekte sonuç alınmamasında ejakülatta çıkan spermlerin DNA molekülündeki hasarlar sorumlu tutulmuştur. Hasar miktarındaki artışın, spermin testisi terk ettikten sonra maruz kaldığı faktörlerden kaynaklandığını önermektedirler. Oysa testislerden alınan spermlerde bu hasarlanma oranları anlamlı derecede düşük bulunmuştur. Bunun üzerine araştırıcılar, bir grup erkekte ejakülat spermi yerine testislerden TESE/TESA ile aldıkları spermleri kullanarak tüp bebeği tekrarladıklarında, daha önce sonuç alınamamış çiftlerin %44’ünde gebelik sağladılar. Hâlbuki ejakülat spermi kullandıkları zaman sadece 1 çiftte gebelik gelişti ve bu da düşükle sonuçlandı (27). Bütün bu sonuçlar, daha önce tüp bebek ile gebelik sağlanamayan çiftlerde, erkeğin testislerinden alınacak spermlerin kullanılmasının başarıyı artırabileceğini vurgulamaktadır. Ancak bunu desteklemeyen çalışmalar da vardır (29). Yine de, başarısız tüp bebek denemelerinde testis sperminin kullanılması konusunda emin olmak için daha fazla sayıda çalışmaya ihtiyaç olduğu kabul edilmelidir.
Tüp bebek için sperm sayısında bir sınır yoktur. Azoospermik olgularda bile testislerden elde edilen spermatozoa, hatta spermatid kullanılarak gebelik elde edilebilir. Bütün bu uygulamalarda başarının en önemli koşullarından biri sperm hücresinin canlı olmasıdır. Bir spermin yumurtayı fertilize edebilecek kalitede canlılığa sahip olup olmadığı hipoosmotik ortamda şişme (HOS) testi veya eozin-Y vitalite boyama testi ile ortaya konulabilir. Bu testler sperm hücresinin membran bütünlüğünü gösterir. Canlılığını kaybetmiş spermlerde membran yapıları bozulacağı için, testlerde olumsuz sonuçlar alınır. Spermler hareket etmese de, canlı oldukları ortaya konmuşsa bunların kullanılması ile sağlıklı tüp bebek gebelikleri elde edilebilir.
Sperm tahlilinde lökosit görülmesi, tüp bebek başarısını önemli derecede düşürür. Dünya Sağlık Örgütü WHO kriterlerine göre semende 1 milyon/ml’den fazla lökosit görülmesi patolojiktir. Ancak, immatür germ hücrelerinin yani tam olgunlaşmamış spermlerin lökositlerden ayırt edilmesi gerekir. Monoklonal antikor tekniği ya da peroksidaz boyası bu ayrımı yapmada sık kullanılan yöntemlerdir. Lökosperminin üreme fonksiyonları üzerine etkisi hem sperm sayı, motilite ve morfoloji bozukluğu yaparak hem de yumurtayla birleşmesini önleyerek ortaya çıkar. Lökospermi her ne kadar bakteriyal ya da viral enfeksiyonlarla birlikte görülebilirse de, olguların %80’inde bakteriyolojik testler negatif çıkmaktadır. Burada yaşam tarzı ya da hücresel immünite rol oynuyor olabilir.
Sigara içimi gibi çevresel faktörler, sperm üretiminde azalma, uzun cinsel perhizler, ya da varikosel lökospermiye neden olabilir. Lökositlerin fertilizasyon bozukluğu yapmasında rol oynayan başlıca faktörler oksidatif stres ve salgıladıkları sitokinlerdir. Bunların yanı sıra HIV, sitomegalo virüs ya da klamidya gibi patojenleri taşıyarak da seksüel geçiş gösteren hastalıkların yayılmasında etken olabilir. Bütün bu nedenlerden dolayı lökosperminin giderilmesinden sonra tüp bebek uygulamasına geçilmesi önemli bir tedbir olarak ele alınmalıdır.
Tüp bebeğe karar verilen erkekte uygulama öncesinde dikkat edilmesi gereken bir diğer durum ise semende enfeksiyon bulunmasıdır. Gonokok dışında erkek genital sisteminde en sık rastlanılan enfeksiyon etkeni gram (-) basiller ve özellikle E. coli’dir. Genellikle peniz ucunda yanma, ağrılı ejakulasyon, akıntı gibi belirtilerle birlikte seyrederler. Gram (-) basiller sperm motilitesi ve canlılığı üzerine olumsuz bir etkiye sahiptir. Spermlerin kümeleşmesine yani aglütinasyona yol açarlar. Genital bezlerin de bu mikroorganizmalar ile enfekte olmaları durumunda sperm fonksiyonları olumsuz etkilenebilir. Enfeksiyna eşlik eden lökositlerin de oksidatif stres ve sitotoksik sitokinlere bağlı olarak sperm sayı, motilite ve morfolojisinde bozulma yapmaları mümkündür. Klinik olarak bakteriyel enfeksiyon bulunan erkeklerde antibiyotik tedavisini takiben seminal parametrelerde düzelme ve gebelik şansında artış elde edilebilir. Diğer yandan, infertil erkeklerin önemli bir kısmında herhangi bir belirti vermeyen, asemptomatik enfeksiyon bulunabileceği de unutulmamalıdır. Ancak, genital sistemin subklinik enfeksiyonlarının infertilitedeki rolü kesin değildir. Semptomların yokluğu, seminal plazmanın antibakteriyal etkisi, uretral mikroorganizmalarla kontamine olmaları ve kültürlerindeki teknik güçlükler nedeniyle subklinik genital enfeksiyon tanısı koymak güçtür. Klinik enfeksiyon belirtisi vermeyen infertil erkeklerin büyük kısmında sperm kültürlerinde bir mikroorganizma çıkabilir.
Spermi enfekte eden klamidya trakomatis ve ureaplasma urealitikum cinsel yolla bulaşan, özellikle seksüel yönden aktif, 35 yaş altı genç, bir belirti vermeyen erkeklerin uretra ya da epididimlerinde yerleşebilen mikroorganizmalardır. Hiçbir belirti vermese de erkeklerin %10-25‘inde bulunur.
Ureaplasma urealyticum, asemptomatik erkeklerin uretrasından sıklıkla izole edilebilen önemli bir mikroorganizmadır. Fertil erkeklerin semen kültürlerinde %23 oranında ürerken, infertillerde bu oran %85′ e çıkmaktadır. Ureaplasma sperm fonksiyonlarını, motilitesini ve fertilizasyon kapasitesini bozarak infertiliteye neden olur. Germ hücrelerinin membranına bağlanarak, sperm yapımını önemli ölçüde bozabilmektedir. Elektronmikroskopi ve immünfloresan teknik kullanarak insan spermatozoasının orta-parça ve post-akrozomal bölgelerine ureoplazmanın tutunduğu gösterilmiştir. Bunun fertilizasyon üzerine etkilerini inceleyen deneysel çalışmalarda seminifer tubüllerde dejenerasyon ve spermatogenezde belirgin bozulma geliştiği anlaşılmıştır. Hayvan çalışmalarında bu mikroorganizmaların gebeliği engellediği ve düşük doğum ağırlıklı doğumlara yol açtığı gösterilmiştir.
Ureoplazma bir vektör gibi yabancı DNA parçalarını embriyoya taşıyabilir. Bilindiği gibi bu tür mikoplazmalar hücrelere kolayca geçebilme özelliğine sahiptirler. Blastosist aşamasındaki embriyolar BRCA1 DNA’sı içeren besi yerinde inkübe edildiklerinde, eğer ortamda canlı ureoplazma bulunuyorsa bu DNA’nın blastosist içerisine girdiği gösterilmiştir. Bu bulgular, enfekte semenlerin yıkansalar bile, tüp bebek sırasında bazı DNA parçalarını oosit ya da embriyo içine taşıma riski yarattıklarını göstermektedir. Belki de fertilizasyon başarısızlıkları veya embriyo kayıplarında bu mekanizma sorumludur.
Ureaplasma urealyticum’un uygun bir antibiyotikle tedavisini takiben gebelik başarısı %60’a çıkmaktadır. Oysa bu ajanın sebat ettiği olgularda gebelik oranları % 5 civarında kalır.
Benzer şekilde, bir diğer mikroorganizma olan klamidya trakomatis ile enfekte erkeklerin de %10-25’i herhangi bir bulgu vermezler. Bu mikroorganizmaların immünolojik olarak seminal parametreleri baskıladığı gösterilmiştir. Klamidyanın enfeksiyonu hücrelere taşıyan parçacığına elementer cisim adı verilir. Elementer cisim hücre yüzeyine yapışır ve arkasından endositoz ile içeri alınarak, hücre içinde yaşamına devam eder. Bu sırada dış çeperi koruyucu bir zar ile çevrelenir. Hücre içinde replikatif forma dönüşen bu cisimler zamanla bölünerek sayıca artarlar. Daha sonra hücre zarını parçalayarak bu cisimcikler enfeksiyöz form halinde tekrar dış ortama çıkar ve diğer hücreleri enfekte etmek üzere yayılırlar. Gerçekten de elektronmikroskopik çalışmalarda klamidyanın insanda spermatozoa membranına bağlanabilme, hatta içerisine girebilme potansiyeline sahip olduğu ortaya konmuştur. Klamidyanın enfeksiyöz elementer cisimleri sperme girdikten sonra çekirdek içerisine geçerler. Neticede hem fertilizasyonu bozar hem de kadına geçerek onu da enfekte edebilirler. Klamidya spermin sadece başına değil kuyruğuna da bağlanabilir ve hatta içerisine girebilir. Spermin morfolojik incelemesinde başın hemen altındaki nodüler oluşumların aslında buraya tutunmuş mikroorganizmalar olabileceği gösterilmiştir.
Uretradan alınan yayma örneklerinin immünolojik teknikler kullanılarak incelenmesiyle klamidya tanısı konulabilir. Klamidya invaziv olarak yayıldığında epididimo-orşit, testis atrofisi ya da obstrüksiyon yaparak infertiliteye yol açabilir.
Enfekte semenlerde tüp bebek sırasında mikroorganizmaların da yumurtanın içerisine verilmesi mümkündür. Aslında semen sıklıkla mikroorganizmalar tarafından kontamine haldedir. Bu mikroorganizmaların bir vektör gibi davranarak, genetik materyalleri ya da proteinleri oosite taşıyıp taşımadıkları konusu henüz açıklığa kavuşmuş değildir. Günümüz bilgileri, böyle bir tehlikenin en azından bakteriler için minimal olduğu veya hiç olmadığı yönündedir. Çünkü spermin antibiyotik içeren besi yerlerinde hazırlanıyor olması, tüp bebek sırasında tek bir spermin yumurtaya verilmesi ve kültür süresinin kısalığı bakteriler için bu riski azaltmaktadır.
Diğer yandan, spermler virüsler tarafından da enfekte edilebilir. Virüsler, insan sağlığında ciddi sorunlar ortaya çıkarabilen mikroorganizmalardır. Özellikle uzun süre devam eden enfeksiyon oluşturduklarında spermin de içine girerek yumurtayla birleşme ve fertilizasyon (döllenme) fonksiyonunu önleyebilir. AIDS, Hepatit B ve Hepatit C virüslerinin başta hareketi olmak üzere sperm değerlerini bozduğu, DNA hasarlarına yol açtığını ortaya konmuştur. Bunların dışında daha nadir görülen virüsler de vardır: HPV (human papillomaviruses), HSV (herpes viruses), HCMV (cytomegalovirus) ve AAV ( adeno associated virüs).
Son yıllarda bu virüslerin sperm parametrelerini bozduğu ve hatta düşüklere neden olabileceği yönünde veriler birikmeye başladı. Daha da önemlisi, virüslere karşı kullanılan antiviral ilaçların da sperm değerlerini olumsuz etkilemeleri söz konusudur.
Bu nedenlerden dolayı çocuk olmaması nedeniyle başvuran çiftlerde spermin viral enfeksiyonlar yönünden de araştırılması, eğer böyle bir durum saptanırsa spermin yıkanarak üremeye yardımcı tekniklere (aşılama, tüp bebek) geçilmesi önerilir. Viral enfeksiyonlarda sperm yıkaması daha titiz tekniklerle yapılır.
Virüsün DNA’sı sperme bağlanarak içerisine girebilir. Tüp bebek sırasında semenin yıkanarak hazırlanması mikroorganizmaları büyük oranda ortamdan uzaklaştırsa da virüs DNA’sı bağlanmış spermatozoalar ortamdan uzaklaştırılamamaktadır. Gerçekten de, HPV (human papillomavirus) ile kontamine semen yıkandıktan sonra bile HPV-DNA’sı taşıyan sperm hücrelerinin elimine edilemedikleri, bu DNA’ların hücre yüzeyine yapıştıkları ve büyük olasılıkla spermatozoanın içine girerek metabolizmasını etkilediği PCR ile yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Böyle yabancı DNA parçacıklarının spermatozoa içerisinde nasıl taşındıkları, taşınıyorlarsa ICSI sırasında oosite geçip geçmedikleri ve gelişecek embriyonun genetik yapısı ile birleşme durumları üzerinde araştırmalar devam etmektedir.
Bütün bu veriler, infertil erkeklerin araştırılmasında spermdeki mikroorganizmaların araştırılmasının ne kadar önemli olduğunu göstermektedir. Fertlizasyondaki negatif etkileri, lökospermi ve buna bağlı sitotoksik ajanların ortama geçmesi ile immünolojik sonuçları nedeniyle, spesifik olarak mikroorganizma üretilen ya da lökospermi saptanan olgularda enfeksiyonun ve artmış lökositlerin tedavisi önemle düşünülmesi gereken bir konudur.
