Kaan Aydos
Primer testiküler yetmezliğe bağlı non-obstrüktif azoospermi olguları, sperm elde edilmesindeki güçlükler nedeniyle halen üzerinde çalışmaların devam ettiği bir konu olma özelliğini korumaktadır. Testiküler sperm ekstraksiyonu (TESE) tekniğinde son yıllarda elde edilen ilerlemeler neticesinde bu olguların da %24-81’inda spermatozoa elde edilebilmekte ve %18 ile 38 arasında gebelik sağlanabilmesine rağmen, yine de testis biyopsilerinde total germinal aplazi ya da maturasyon duraklaması bulunan erkeklerin %58-76’sında, sperm elde edilmesinde başarısız kalınmaktadır (1,2). Burada en önemli sorun hangi olgularda matür sperm bulunabileceğinin önceden tahmin edilebilmesi ve uygulamanın teknik olarak başarısıdır.
TESE İLE HÜCRE ELDE ETME BAŞARISI ÜZERİNE PROGNOSTİK FAKTÖRLER
Testislerden alınan doku örneklerinde matür sperm hücresi bulunup bulunamayacağının bazı tetkikler ile önceden belirlenmesi, gerek erkekte gerekse kadında ICSI uygulamasına ait olumsuz sonuçlarla karşılaşılmasını önleyecektir.
Serum inhibin B ve FSH ölçümleri
Follikül stimüle edici hormon (FSH); Sertoli hücreleri üzerinden hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler gibi değişik proteinlerin yapımını uyararak ya da inhibe ederek testis fonksiyonlarını düzenler (3). Hipofizden FSH salınımı ise esasen Sertoli hücreleri tarafından yapılan inhibin B tarafından kontrol edilir. İnhibin B testosteron ile birlikte diürnal bir ritim gösterir. Sabah en yüksek değerine ulaşırken akşama doğru düşme eyilimindedir (4). Sağlıklı ve infertil erkeklerde inhibin B’nin sabah ölçülen serum konsantrasyonları FSH, sperm sayımı ve testis volümü ile de korele bulunmuştur (5). İnhibin B salgılanmasının kontrolünde germ hücrelerinin de rolü bulunduğu ortaya konmuştur (6). Rat testisinde, seminifer tubüllerden inhibin B salgılanması esasen spermatidlerin varlığına bağlıdır (7). İnhibin B düşük ise, spermatidlerin de bulunmadığı sonucuna varılabilir.
İnfertil erkeklerin tanısal araştırmalarında serum FSH ölçümü geniş çapta kullanılmakla birlikte, FSH, azoosperminin yapısı ve testis dokusunda spermatozoa varlığı bakımından yeterli olmamaktadır. Azoosperminin şeklini inhibin B daha doğru yansıtır. Özellikle Sertoli cell only sendromu (SCOS)’nda muhtemelen Sertoli hücresindeki hasar nedeniyle serum konsantrasyonu en düşük seviyesine iner (8). Ancak serum FSH düzeyleri ile inhibin B düzeyleri arasında her zaman aynı uyum görülmeyebilir. Örneğin bir grup oligozoospermik erkekte yükselmiş serum FSH’sı ile birlikte normal inhibin B düzeyleri bildirilmiştir (9). Dolayısıyla, ne çok yükselmiş serum FSH seviyesi ne de düşmüş inhibin B düzeyi TESE sırasında spermatozoa elde edilebileceğini ekarte etmemektedir (10).
Testis biyopsilerinin histopatolojik tanılarında, serum FSH ve inhibin B konsantrasyonları birbirleriyle ters korelasyon ortaya koyarlar (11). SCOS’da kontrol grubuyla karşılaştırıldığı zaman, inhibin B anlamlı düzeyde düşmektedir (9). Tanısal testis biyopsilerinde uzamış (elongated) spermatidlerin varlığını göstermede FSH ve inhibin B konsantrasyonlarının birlikte ölçümlerinin daha yüksek sensitivite ve spesifisiteye sahip oldukları bildirilmektedir (12). Benzer ilişki seminal plazma inhibin B seviyesi ile de gösterilmiştir (13). Her ne kadar çalışmalar bu yönde olsalar da, ne inhibin B ne FSH ne de ikisinin birlikte ölçümü TESE sırasında matür sperm hücresi bulunabileceğini tahmin ettirmede yeterli değildirler.
Ejakulatta germ hücrelerinin bulunması
Amer, ejakulatın May-Grünwald-Giemsa (MGG) ile boyalı preparatlarında yuvarlak (round) spermatid bulunan olguların önemli bir kısmında testislerinden spermatozoa elde edilebileceğini göstermiştir. TESE ile spermatozoa bulunan olguların %83’ünde ejakulatlarında yuvarlak spermatid ayırt edilmektedir. Buna dayanarak, ejakulatın boyalı preparatlarında spermatid aranmasının TESE sonucunu tahmin etmede yüksek duyarlılıkta, ekonomik ve invaziv olmayan bir yöntem olduğunu ileri sürmektedir (14).
Non-obstrüktif azoospermi olgularının ejakulatında, Sertoli hücreleri ile olan bağlantılarını erken kaybederek lümene dökülmüş immatür germ hücrelerine sıklıkla rastlanılmaktadır. Ejakulatta farklı evrelerdeki germ hücrelerinin miktar ve canlılıklarının ölçülmesinin, invaziv tanısal yöntemlere gerek kalmaksızın testis fonksiyonu konusunda bilgi verebileceği önerilmektedir. Germ hücrelerinin ejakulatta bulunan diğer yuvarlak hücrelerden ayırt edilmesi her zaman kolay olmayabilir. Ancak, ejakulatta spermatid varlığının gözlenmesinin TESE sırasında testis dokusundan spermatozoa elde edilebileceğini önceden bildiren bir markır olabileceği bazı araştırıcılar tarafından savunulmaktadır (15). Testis dokusunda spermatogenezin fokal odaklar halinde bulunabileceği azoospermi olgularında, ejakulatta spermatid bulunmuş olsa bile testis biyopsilerinde spermatid ya da spermatozoaya rastlanılamıyabileceği de unutulmamalıdır.
Testis biyopsisi
Testis biyopsisi sonuçlarına bakarak TESE ile spermatozoa elde etme oranları karşılaştırıldığında, biyopsi sonucu komplet SCOS ya da komplet maturasyon duraklaması gelse bile, TESE sırasında bunların sırasıyla %19-33 ve %33-48’inde en azından bir spermatozoa bulunabilmektedir (16,17). Ezeh, spermatogenez bozukluğu bulunan bir grup olguda eş zamanlı olarak çoklu iğne biyopsisi ve açık testis biyopsisi sonuçlarını karşılaştırdığı çalışmasında, sırasıyla %14 ve %63 oranlarında spermatozoa elde edebilmiş ve sonuçta açık testis biyopsilerinin hücre elde etmede daha üstün olduğu görüşünü bildirmiştir (15). Biyopsilerin histopatolojik incelemeleri, germinal aplazi bulunan olgularda aynı zamanda komşu tubüllerde fokal normal spermatogenez odaklarının da bulunabileceğini göstermektedir. Böyle miks olgularda TESE ile %65’inde sperm bulunabilmektedir (18). Hatta, Klinefelter’s sendromu ve tubüler skleroz bulunan biyopsi olgularının bile %25’inde sperm elde etmek mümkün olabilmektedir. Testis biyopsisi hipospermatogenez gelen olguların %85’i civarında, erken spermatid duraklaması olan olguların ise %80’inde TESE sırasında ICSI’de kullanılabilecek matür spermatozoa elde edilebilmektedir (17).
Silber, ejakulata en az bir spermatozoanın erişebilmesi için testis biyopsisinde seminifer tubüli başına ortalama 3 veya daha fazla matür spermatid bulunması gerektiğini göstermiştir (19). Bu eşik değeri aşan spermatid sayılması, ileride ICSI yapılacak azoospermik olgularda ejakulatlarında da detaylı arama ile spermatozoa bulunabileceğini belli etmesi bakımından değerli olabilir.
Bu sonuçlar tanısal amaçlı yapılan testis biyopsilerinin, TESE sırasında sperm elde etme başarısı üzerine tahminde bulundurabilecek sonuç vermeyeceğini, sadece başarı oranını belirlemede etkin olacağı kanısını vermektedir. Diğer yandan, tanısal amaçlı biyopsiler testislere ait başka patolojilerin, bazı sistemik hastalık tutulumlarının ve erken evre tümörlerin tanınmasında kuşkusuz faydalı olacaktır.
Y-kromozom delesyonları
TESE yapılacak olgularda daha önceden Y kromozomundaki delesyona uğramış bölgenin tespit edilmesinin, TESE sırasında hücre bulma şansını tahmin etmede prognostik öneme sahip olduğu ortaya konmuştur (20). AZFc bölgesini de içine alan kombine delesyonlarda (AZFb+c, AZFa+b+c) testiküler spermatozoaların total yokluğu söz konusudur.
AZFb delesyonlarının prognozu ise oldukça kötüdür.
Tek başına AZFc delesyonlarında ise %50 olguda matür spermatozoa bulunmaktadır.
AZFb delesyonu gelen olgularda mayoz sırasında veya daha öncesinde spermatogenezde duraklama gelişmektedir. Ancak AZFb delesyonlarının da farklı subtipleri bilinmektedir. Bütün AZFb bölgesini kaplayan komplet delesyonlarında spermatosit veya spermatid seviyesinde duraklama oluşmaktadır.
Komplet AZFb delesyonu + AZFa ve/veya AZFc delesyonları ise SCOS ya da spermatogenetik duraklama ile birliktedir. Oysa yalnızca o bölgenin bir parçasının silindiği parsiyel AZFb delesyonlarında, oligozoospermiyi de içeren daha heterojen sonuçlar ortaya çıkmaktadır.
AZFa ve AZFc delesyonlarında da azoospermi bulunabilir. AZFa delesyonları çok nadir olup, SCOS tip I ile birlikte görülür. AZFc bölgesi delesyonlarının durumu ise biraz farklıdır. AZFc delesyonları genellikle hipospermatogenez ya da SCOS tip II’ye eşlik eder. SCOS tip II’de multipl biyopsiler alındığında normal spermatogenez gösteren izole adacıklar bulunabilir. Ancak, son çalışmalarda AZFa-b-c bölgelerinin tamamını içine alan delesyonlar dışındaki her türlü ikili kombine delesyonlarda TESE ile hücre bulunabileceği kanısı yaygınlaşmaktadır (21).
Testis volümü ölçümü
Testis içinde spermatogenezin topografik dağılımı volüm ile bir ilişki göstermediği için, TESE’de hücre bulma olasılığını tahmin etmede testis volümü tayini yol gösterici özelliğe sahip değildir. Histopatolojisi SCOS olmasına rağmen normal volüm gösteren bir testiste, spermatozoa bulma şansı da düşük olacaktır. Diğer yandan, küçük volümlü bir testis, maturasyon duraklaması gösterse bile TESE’de hücre bulunamıyacağını da ifade etmez (22). Normal volümlü testislerin ancak %44’ünde sperm elde edilebilirken, çok küçük volümlü testislerin de %25’inde yine hücre bulunabileceği bildirilmiştir (14). Aynı çalışmada volüm < 5ml testislerde de ICSI’de kullanılmak üzere matür spermatozoa elde edilebilmiştir.
Vimentin ve sitokeratin immünohistokimyasal analizi
Sertoli hücresi sitoplazması içerisinde özellikle nukleus çevresinde ve apikal bölgede lokalize, fibriler bir ağ yapısı teşkil eden ara (intermediate) filamentler bulunur. Bunların vimentin tipinde olmaları Sertoli hücrelerinin mezenşimal orijinli olduğunun bir göstergesidir (23).
Embiyonik dönemde Sertoli hücrelerinin sitoplazmik iskeletini hem vimentin hem de sitokeratin tip 18 ve 28 filamentleri oluşturmaktadır. Sitokeratinin epitelial orijin ile ilişkili olması ve doğumdan sonra puberteye kadar tamamen kaybolması, Sertoli hücrelerinin maturasyonları sırasında fonksiyonel farklılaşmaya uğradığını düşündürmektedir (24).
Erişkinlerde Sertoli hücresi sitokeratin tipi filamentler göstermezken, fötal ve puberte öncesi dönemler ile patolojik durumlarda sitokeratin görülebilir. Germinal epitel ise epitelial orijinli olduğu için vimentin içermez ama diğer epitel dokularından farklı olarak sitokeratin de bulundurmamaktadır.
Bu özelliklerinden yararlanılarak, testis biyopsisi dokusunun immünohistokimyasal tekniklerle boyanarak vimentine bakılması, gerçek Sertoli cell only tablosunun araştırılmasında önerilmiştir. Seminifer tubüllerde sadece Sertoli hücreleri vimentin ile boyanma göstereceği için, boyanma göstermeyen hücrelerin bulunması SCO sendromunu ekarte ettirecektir. Diğer yandan, immünohistokimyasal olarak sitokeratin tip 18 ve 28’in görülmesi de Sertoli hücrelerinin maturasyon yetmezliği için bir bulgu olabilir. Tanısal biyopsi örneklerinde Sertoli hücreleri içerisindeki filament proteinlerinde vimentinin varlığı ile birlikte sitokeratin bulunmaması, pür SCOS için immünohistokimyasal bir kanıt olabilir (25). Ancak bu markırların hassasiyetini ortaya koymak için daha geniş serilerin araştırılmasına gerek vardır.
Sertoli hücrelerinde lipid granüllerinin bulunması
Normal testislerde Sertoli hücreleri sitoplazmalarında bol miktarda lipid granülleri bulundururlar. Bunlar spermiasyon sırasında spermatidlerin sitoplazmik artıklarından kaynaklanmaktadır. Sertoli hücrelerinin dejenere germ hücrelerini absorbe etmeleri durumunda sitoplazmalarında bol miktarda lipid granülleri birikecektir.
Pür SCOS olgularında ise Sertoli hücreleri germ hücreleri ile hiç temas etmedikleri için, sadece çok az miktarda lipid ve glikojen içerirler. Bu nedenle, sitoplazmik lipidlerin azalmış olması, sitoplazmik artıklarla ilgili herhangi bir metabolik faaliyetin gerçekleşmemiş olduğunu ve dolayısıyla spermatidin de bulunmadığını gösterir (24).
Telomer ölçümü
Hücre bölünmesinde sürekli olarak kısalan, kromozomların ucundaki telomer sekanslarının yeniden yapılandırılabilmesi için, telomeraz aktivitesine gereksinim vardır. Hücresel ölümsüzlük mekanizmasının altında da sürekli telomeraz varlığı mekanizması öngörülmektedir (26). Testiste telomeraz aktivitesinin bulunduğu ve bunun sadece germ hücrelerine ait olduğu gösterilmiştir. Fareler ve ratların yanı sıra insanda da telomeraz aktivitesi varlığı değişik çalışmalarda bildirilmektedir (27,28).
Spermatogenetik hücrelerde bu enzimin aktivitesi mayotik ve post-mayotik süreç boyunca azalmaktadır. En yüksek seviyeleri spermatogonia ve primer spermatositlerde tespit edilirken, yuvarlak spermatidlerde en az bulunur. Testiküler ve epididimal spermatozoalarda hiç gösterilmemiştir (29,30).
Ancak, germ hücrelerinin hangi basamağında telomeraz aktivitesinin daha fazla olacağı henüz kesinlik kazanmamıştır. Obstrüktif azoospermi ile maturasyon duraklaması olan erkeklerin testis biyopsi örneklerinde telomeraz aktiviteleri bakımından bir fark bulunamamıştır (31). Normal spermatogenez, hipospermatogenez ve maturasyon duraklamalı erkeklerde ise telomeraz aktivitesi mevcut olmakla birlikte, SCOS’lu erkeklerde bu enzime rastlanılmaz. Testis dokusunda birim ağırlığı başına telomeraz aktiviteleri ile spermatogenez kalitesinin karşılaştırıldığı daha duyarlı kantitatif deneylerde, haploid germ hücreleri (spermatozoa veya spermatidler) varsa telomeraz aktivitesinin de artacağı bildirilmektedir (28).
Yukarıdaki bulgular değerlendirildiğinde, SCOS olgularında hiç telomeraz aktivitesinin bulunmadığı, bu aktivitenin varlığında ise herhangi bir seviyede germ hücresinin bulunabileceği düşünülerek, obstrüktif olmayan azoospermi olgularında gerçek SCOS’nun tanınmasında bu enzimin bir markır olarak kullanılabileceği önerilmektedir (24).
Tanısal amaçlı biyopsilerde telomeraz bulunması germ hücrelerinin varlığı için bir kanıt olarak önerilebilir. Kantitatif telomeraz testleri ise haploid hücre varlığı için bir göstergedir. Eğer tespit edilirse haploid germ hücrelerinin bulunduğu miks SCOS tanısı yönünde uyarmalıdır. Bu durumda miks SCOS’lu olgular ICSI programına alınabilirler. Haploid hücre odaklarının bulunmaması ise pür SCOS’na işaret eder ve bunlarda ICSI için uygun germ hücresi bulunamıyacağı düşünülebilir.
TESE TEKNİĞİ
Bazı otörler spermatogenezin tüm testis dokusu içinde multi-fokal dağılımına dayanarak, TESE için tek bir biyopsinin yeterli olacağını savunurlarken (32), diğerleri örneklemenin arttırılmasıyla sperm bulma şansının daha fazla olacağı görüşündedirler (33). Biyopsi sırasında örneklemenin arttırılması ise testisin kan dolaşımında bozulma (34) ya da fibrozis ve immün hasar (35) gibi yan etkilere yol açabilmektedir. Schlegel, TESE’nin spermatogenez üzerine yaptığı zararlı etkilerin aylarca devam edebileceğini, ve bu nedenle aynı testise 6 ay geçmeden işlem uygulanmaması gerektiğini ileri sürmüştür (34). Diğer yandan son zamanlarda, çok sayıda alınan biyopsilerin yapacağı zararlı etkileri en aza indirmek amacıyla mikrocerrahi yöntemler kullanılarak testis doku örneklerinin çıkarılması tekniği önerilmektedir (36).
Devroey, SCOS’u germ hücrelerinin komple bulunmadığı total ve bazı normal tubüllerin de eşlik ettiği parsiyel olmak üzere iki grup halinde sınıflandırmıştır (37). Parsiyel germinal aplazi olgularında multipl biyopsiler alındığında TESE ile %50’sinde spermatozoa elde edilebilmektedir. Bu oran komple aplazilerde son derece düşmektedir.
Tek bir biyopsi alındığında spermatogenezin varlığı gösterilememiş ise, bu durumda total germinal aplaziden söz etmek doğru olmayacaktır. Çünkü, biyopsi sayısı arttırıldıkça, spermatozoa bulma şansı da artmaktadır. Amer, obstrüktif olmayan azoospermi bulunan 216 hastada, özellikle maturasyon duraklaması ve kombine patolojilerin bulunduğu olgular olmak üzere, tek biyopsi ile %37.5 olguda spermatozoa elde edilirken, çoklu biyopsi örneklemesi ile bu oranın %49 gibi anlamlı bir yükselme göstereceğine işaret etmiştir (18). Ancak çoklu biyopsilemede biyopsi sayısının kaç olması gerektiği konusu oldukça tartışmalıdır.
Biyopsi sayısının arttırılması her ne kadar ICSI yapılma şansını da artıracak olmakla birlikte, bu işlem önemli riskler de taşımaktadır. Çoklu biyopsileme ile TESE yapılması neticesi testislerde total devaskülerizasyona kadar giden atrofik değişiklikler gelişebilir.
Yakın zamanlarda tanımlanan mikrocerrahi-TESE yöntemi, ICSI günü yapılan TESE sırasında spermatozoa bulamama olasılığına karşı hem hücre bulma şansını arttırmakta, hem de çoklu biyopsilemenin potansiyel zararlarından kişiyi korumaktadır. Aydos, mikrocerrahi-TESE ile spermatozoa elde etme oranının (%51) çoklu biyopsilemeden (%37) anlamı ölçüde yüksek bulunabileceğini bildirmiştir (38). Burada spermatozoa içeren matür tubüllerin mikroskop altında tanınabilmesi en önemli etkendir. Ameliyat mikroskopu altında matür seminifer tubüllerin ayırd edilebilmesi, çıkarılan doku volümünü de önemli ölçüde azaltır.
Diğer yandan, mikroskop altında gözlenebilen küçük damarlar ve kanama odakları da daha efektif kontrol edilebilirler. Seminifer tubüller mikroskop altında incelendiğinde, içerisinde spermatogenezin normal olduğu tubüller, çok miktarda hücre içermeleri nedeniyle, diğerlerine göre daha geniş, opak ve dolgun görülmektedirler. Sklerotik tubüller ise kollaps durumundadırlar.
Mikrocerrahi yöntemle yapılan TESE’nin, randomize çoklu testis biyopsilerine göre daha fazla oranda spermatozoa bulma şansı verebileceği, ve tanımlanan yöntemle yapılan mikroskopik-TESE’nin obstrüktif olmayan azoospermi olgularında hücre elde etmede daha etkili ve gerek çıkarılan doku hacminin azlığı, gerekse geride kalan testis dokusuna hemen hiç zarar vermemesi bakımlarından minimal invaziv bir yöntem olduğu düşünülmektedir.
TESE İLE ELDE EDİLEN DOKUNUN MEKANİK YA DA ENZİMATİK YÖNTEMLERLE AYRIŞTIRILMASI
TESE için alınan testis biyopsilerinde spermatozoa aranmasında sıklıkla mekanik ayrıştırma yöntemi kullanılmaktadır. Burada seminifer tubülilerin bazal membranları mekanik olarak parçalanarak, lümende bulunan az sayıdaki germ hücrelerinin ortama geçmeleri sağlanılmaktadır. Bu sırada spermatozoaların yanısıra yuvarlak germ hücreleri, interstisiyel hücreler ve Sertoli hücreleri de açığa çıkmaktadır. Ancak işlem sırasında bir kısım hücreler parçalanmakta ve ortama dejenere olmuş hücre artıkları, serbest nukleuslar ve rezidü doku parçaları ile toksik serbest oksijen radikalleri de çıkar (39). Diğer yandan, mekanik ayrıştırma yapıldıktan sonra bir miktar spermatozoa ve spermatidin Sertoli hücrelerinden ayrılmayarak yapışık kaldıkları ve lümene dökülmedikleri görülmektedir.
Mekanik parçalamadan başka, testis dokusundan hücre elde etmede kollagen liflerini ayrıştırmak ve hücreler arasındaki bağlantıları kopararak serbestçe lümene dökülmelerini sağlamak amacıyla enzimatik ayrıştırma teknikleri de denenmiştir. Bu amaçla trypsin-Dnase, trypsin tip III ve collagenase tip I kullanılmış ve başarılı sonuçlar bildirilmiştir (40,41). Aydos, mekanik yöntem ile hücre bulunamayan olguların %15’inde kollajenaz tip IV enzimatik ayrıştırma yöntemi ile ICSI’de kullanılabilecek motilite ve matüritede spermatozoa elde edilebileceğini, bir grup nonobstrüktif azoospermili erkekte ortaya koymuştur (42).
Kollagenaz; dokuların ayrıştırılmasında yaygın olarak kullanılan oldukça spesifik bir proteazdır. İnsanda da testislerden sperm elde edilmesinde başarıyla kullanılmıştır (43). Fisher, bu yöntem ile insanda ilk gebelik bildirenlerdendir (44). Crabbe, kollajenaz IV’ün in vivo ortamda germ hücrelerinin yer değiştirmesinde ve spermiasyon sırasında matür spermatozoaların lümene salınmasında rol oynayabileceğini ileri sürmektedir (39).
Ancak, hücre süspansiyonu ortamına enzim konmasının bu hücrelerin fertilizasyon kapasitelerini nasıl etkilediğinin daha geniş serilerde araştırılması gerekmektedir. Bu nedenle, non-obstrüktif azoospermi olgularında testis doku örneklerinin mekanik ayrıştırılması işleminin başarısız kaldığı durumlarda kollajenaz tip IV enzimi kullanılarak ayrıştırmaya devam edilmesinin, matür spermatozoa elde edilmesinde etkin bir yöntem olduğu söylenilebilir.
TESE İLE ELDE EDİLEN HÜCRELERİN İN VİTRO MATURASYONUNUN SAGLANMASI
Spermatidlerin ICSI ile fertilizasyon şansının düşük kalmasının en önemli nedeni, yuvarlak (round) spermatid oluşumu sırasında henüz yeni başlamış olan nuklear proteinlerden histonların protaminler ile yer değiştirme işleminde yetersizlikten kaynaklanmaktadır (45). Normalde spermatid oosit içine girdiğinde, maturasyon uyarıcı faktörlerin etkisiyle proteinler arasındaki disülfit bağları kaybolarak dekondanse duruma geçer. Eksperimental çalışmalarda sperm nukleusunda dekondensasyonun başlaması için 45-60 dk. geçmesi gerektiği ortaya konmuştur (46). Bu gecikme süresi normal pronukleusun gelişebilmesi için şarttır.
Erken spermatid döneminde olduğu gibi, protaminlerin henüz oluşmadığı ya da yetersiz olduğu nukleuslarda dekondensasyon çok erken gelişerek prematür dekondensasyon denilen patolojik durum ortaya çıkar. Bu nedenle, başarılı bir fertilizasyonun sağlanabilmesi için mikroenjeksiyondan önce oosit ya stimüle edilerek aktive hale getirilmeli veya maturitesinin tamamlanabileceği bir süre geçmesini bekledikten sonra enjeksiyon yapılmalıdır (47). İşte bu nedenle, in vitro şartlarda germ hücrelerinin yeterli maturasyonlarının sağlanması yoluyla ICSI’de fertilizasyon şansının artırılması önerilmiştir (48).
Her ne kadar yuvarlak spermatid enjeksiyonu ile gebelik elde edilmiş ise de, yuvarlak ve uzamış (elongated) spermatid mikroenjeksiyonları ile elde edilen fertilizasyon ve gebelik oranları arasındaki farklılıklar ve bu immatür hücrelerin taşıdığı potansiyel riskler, spermatid kullanımını henüz üzerinde geniş araştırmaların yapılması gerekli bir konu haline getirmektedir.
Normalde haploid hücreler olan spermatosit ve spermatidler oosit içerisine girdiklerinde, oosit aktivasyonu gelişerek ikinci mayoz bölünmelerini tamamlar. Oysa spermatositler henüz mayozunu tamamlamamış diploid sayılan bir basamakta bulundukları için, bunların in vitro şartlarda haploid hale getirilmeleri gerekir. Bu nedenle sekonder spermatositlerin kullanılacağı olgularda, bunlar, nukleusu içinde fazla miktarda metafaz uyarıcı faktörlerin bulunduğu metafaz II oositi içerisine enjekte edilir. Böylece spermatosit nukleusu spontan olarak metafaza girer. Arkasından da oositin artifisyal uyarımı yapıldığında, her iki hücrenin anafaz safhasına geçmeleri sağlanılabilir (49).
Primer spermatositler de ise haploiditeyi başarabilmek için bu hücrelerin kendileriyle eş dönemde bulunan germinal vezikül oositleri ile manipüle edilmeleri gerekir (50). Bu yolla, tek bir kromozom grubu oluşturacak şekilde her iki gamete ait haploid genetik materyalin elde edilebileceği gösterilmiştir. İn vitro şartlarda nuklear ve sitoplazmik matüritenin sağlanabilmesi ile ilgili uygulamalar başka çalışmalarda detaylı olarak izah edilmiştir (51).
İnsanda aspermatogenezin kültür ortamı içindeki gelişimi değişik çalışmalarda incelenmiştir (52,53). Erkek germ hücreleri in vitro ortamda kısa süreli korunabilmekte, plazma membran proteinleri, aktin ve tubulin gibi çok sayıda protein sentezi yapabilmektedir (54). Eksperimental olarak da pakiten ve diploten dönemindeki primer spermatositler in vitro koşullarda iki mayoz bölünmeyi tamamlayarak, akrozomu bulunan yuvarlak spermatidleri oluşturabilmektedir (55). Primer spermatosit, yuvarlak ve uzamış spermatidler in vitro şartlarda 24 ve 72 saat süreyle viabilitelerini sırasıyla %87 ve %7 sürdürebilmektedirler (48).
Yuvarlak spermatidlerde 4. saatte %8, 8. saatte ise %22’sinde kuyruk oluşumu görülebilmektedir. Burada, kullanılan kültür ortamının ısısı önemli olup, 32-34oC optimal olarak bulunmuştur (48,56). Tsirigotis, azoospermik bir grup olguda TESE doku süspansiyonlarını 37oC’da 72 saat süreyle inkübe ettiğinde, sekretuvar ve obstrüktif olgular için sırasıyla %25 ve %36 gebelik elde etmiştir (57). TESE günü ICSI’ye uygun hücre bulunamayan olgularda, doku süspansiyonu 3 gün inkübe edildiğinde, %32’sinde daha ICSI yapılabilecek matüritede germ hücresi geliştiği gözlenmiştir.
Testis doku biyopsileri, 30oC’da, 24-48 saat süreyle, içerisinde 25mIU/ml rekombinan FSH bulunan ortamda bekletildiğinde, nukleusta kondensasyonun tamamlandığı ve nuklear protruzyon ile flagellum geliştiği izlenmiştir (58). Kültür ortamında Sertoli hücrelerinin de bulunmasının germ hücrelerinin canlılığının korunmasında gerekli olduğu bildirilmektedir (59). FSH’nın mayoz ile birlikte erken ve geç spermatogenezi Sertoli hücreleri aracılığı ile uyardığı düşünülmektedir.
Sperm hücrelerinin in vitro koşullarda bekletilmesi, günümüzde TESE olgularında tercih edilen bir uygulama olarak görülmektedir. Özellikle gereksiz OPU yapılmasının önüne geçmek amacıyla, OPU yapılmadan kaç gün önce TESE yapılmasının uygun olacağı konusunda çalışmalar devam etmektedir111. Obstrüktif azoospermi olgularında daha belirgin olmak üzere, azoospermi olgularında spermatozoaların 72 saatlik özel kültür ortamında bekletilmeleri sonucu motilitelerinin anlamlı ölçüde artacağı önerilmektedir. Bazı merkezlerde spermin 16-24 saat ya da 6-8 saat bekletildikten sonra ICSI’de kullanılmaları rutin olarak uygulanmaktadır (60).
Sonuç olarak, TESE olgularında testis dokusunun belirli bir müddet kültür ortamında bekletilmelerinin ICSI sonuçlarını olumlu etkileyeceği düşünülerek, bu konuda çalışmalar sürdürülmektedir.
1. Schlegel PN: Sperm retrieval techniques for assisted reproduction. Inf Reprod Med Clin North Am 1999; 10: 539-543.
2. Tournaye H, Camus M, Vandervorst M, et al: Sperm retrieval for ICSI. Int J Androl 1997; 20: 69-72.
3. Sharpe RM: Intratesticular factors controlling testicular function. Biol Reprod 1994; 30: 29-33.
4. Carlsen E, Olsson C, Petersen JH, Andersson AM, Skakkebaek NE: Diurnal rhythim in serum levels of inhibin B in normal men: relation to testicular steroids and gonadotropins. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 1664-1669.
5. Eckardstein S, Simoni M, Bergmann M, Weinbauer GF, Gassner P, Schepers AG, Nieschlag E: Serum inhibin B in combination with serum follicle-stimulating hormone (FSH) is a more sensitive marker than serum FSH alone for impaired spermatogenesis in men, but cannot predict the presence of sperm in testicular tissue samples. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 2496-2501.
6. Pineau C, Sharpe RM, Saunders PT, Gerard N, Jegou B: Regulation of Sertoli cell inhibin production and of inhibin alpha-subunit mRNA levels by specific germ cell types.Mol Cell Endocrinol 1990; 30: 13-16.
7. Allenby G, Foster PM, Sharpe RM: Evaluation of changes in the secretion of immunoactive inhibin by adult rat seminiferous tubules in vitro as an indicator of early toxicant action on spermatogenesis. Fundam Appl Toxicol 1991; 16: 710-714.
8. von Eckardstein S, Simoni M, Bergmann M, Weinbauer GF, Gassner P, Schepers AG, Nieschlag E: Serum inhibin B in combination with serum follicle-stimulating hormone (FSH) is a more sensitive marker than serum FSH alone for impaired spermatogenesis in men, but cannot predict the presence of sperm in testicular tissue samples. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 2496-2500.
9. Foresta C, Bettella A, Petraglia F, Pistorello M, Luisi S, Rossato M: Inhibin B levels in azoospermic subjects with cytologically characterized testicular pathology. Clin Endocrinol (Oxf) 1999; 50: 695-699.
10. Jezek D, Knuth UA, Schulze W: Successful testicular sperm extraction (TESE) in spite of high serum follicle stimulating hormone and azoospermia: correlation between testicular morphology, TESE results, semen analysis and serum hormone values in 103 infertile men. Hum Reprod 1998; 13: 1230-1235.
11. .Leifke E, Simoni M, Kamischke A, Gromoll J, Bergmann M, Nieschlag E:Does the gonadotrophic axis play a role in the pathogenesis of Sertoli-cell-only syndrome? Int J Androl 1997; 20: 29-34.
12. Pierik FH, Vreeburg JT, Stijnen T, De Jong FH, Weber RF: Serum inhibin B as a marker of spermatogenesis. J Clin Endocrinol Metab 1998; 83: 3110-3114.
13. Anderson RA, Irvine DS, Balfour C, Groome NP, Riley SC: Inhibin B in seminal plasma: testicular origin and relationship to spermatogenesis. Hum Reprod 1998; 13: 920-925.
14. Amer M, Abd Elnasser T, El Haggar S, et al: May-Grünwald-Giemsa stain for detection of spermatogenic cells in the ejaculate: a simple predictive parameter for successful testicular sperm retrieval Hum. Reprod 2001; 16: 1427-1432.
15. Ezeh UIO, Moore HDM, Cooke ID: A prospective study of multiple needle biopsies versus a single open biopsy for testicular sperm extraction in men with non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 1998; 13: 3075-3079.
16. Tournaye H, Goossens A, Ubaldi F, ve ark. Are there any predictive factors for successful testicular sperm recovery? Hum Reprod 1997; 12: 80-85.
17. Amer M, Ateyah A, Hany R, Zohdy W: Prpspective comparative study between microsurgical and conventional sperm extraction in non-obstructive azoospermia: follow-up by serial ultrasound examinations. Hum Reprod 2000; 15: 653-657.
18. Amer M, Haggar SE, Moustafa T, et al: Testicular sperm extraction: impact of testicular histology on outcome, number of biopsies to be performed and optimal time for repetition. Hum Reprod 1999; 14: 3030-3035.
19. Silber SJ: Microsurgical TESE and the distribution of spermatogenesis in non-obstructive azoospermia. Hum reprod 2000; 15: 2278-2285.
20. Krausz C, et al: Prognostic value of Y deletion analysis. Hum Reprod 2000; 15: 1431-1436.
21. Carlo Foresta, Enrico Moro, and Alberto Ferlin Prognostic value of Y deletion analysis: The role of current methods Hum. Reprod 2001; 16: 1543-1547.
22. Devroey, P., Liu, J., Nagy, Z. et al: Pregnancies after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection in non obstructive azoospermia. Hum. Reprod 1995; 10: 1457-1461.
23. Aumuller G, Steinbruck M, Krause W, Wagner HJ: Distribution of vimentin-type intermediate filaments in Sertoli cells of the human testis, normal and pathologic. Anat Embryol (Berl) 1988; 178: 129-134.
24. .Anniballo R, Ubaldi F, Cobellis L, Sorrentino M, Rienzi L, Greco E, Tesarik J: Criteria predicting the absence of spermatozoa in the Sertoli cell-only syndrome can be used to improve success rates of sperm retrieval. Review. Hum Reprod 2000; 15: 2269-2275.
25. Romeo R, Castorina S, Marcello MF: Intermediate filaments of human Sertoli cells in germinal alterations. Ital J Anat Embryol 1995; 100: 75-80.
26. Herbert B, Pitts AE, Baker SI, Hamilton SE, Wright WE, Shay JW, Corey DR: Inhibition of human telomerase in immortal human cells leads to progressive telomere shortening and cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96: 14276-14281.
27. Wright WE, Piatyszek MA, Rainey WE, Byrd W, Shay JW: Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Dev Genet 1996; 18: 173-177.
28. Yamamoto Y, Sofikitis N, Mio Y, Miyagawa I: Highly sensitive quantitative telomerase assay of diagnostic testicular biopsy material predicts the presence of haploid spermatogenic cells in therapeutic testicular biopsy in men with Sertoli cell-only syndrome. Hum Reprod 1999; 14: 3041-3046.
29. Prowse KR, Avilion AA, Greider CW: Identification of a nonprocessive telomerase activity from mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 15: 1493-1497.
30. Eisenhauer KM, Gerstein RM, Chiu CP, Conti M, Hsueh AJ: Telomerase activity in female and male rat germ cells undergoing meiosis and in early embryos. Biol Reprod 1997; 56: 1120-1125.
31. Fujisawa M, Tanaka H, Tatsumi N, Okada H, Arakawa S, Kamidono S: Telomerase activity in the testis of infertile patients with selected causes. Hum Reprod 1998; 13: 1476-1481.
32. Silber S, Van Steirteghem AC, Liu J, ve ark. High fertilization and pregnancy rates after intracytoplasmic sperm injection with spermatozoa obtained from testicle biopsy. Hum Reprod 1995; 10: 148-155.
33. Ostad M, Liotta D, Ye Z, et al: Testicular sperm extraction (TESE) for non-obstructive azoospermia: results of multibiopsy approach for optimized tissue dispersion. Urology 1998; 52: 692-696.
34. Schlegel PN, Su LM: Physiological consequences of testicular sperm extraction. Hum Reprod 1997; 12: 1688-1692.
35. Tournaye H, Goossens A, Ubaldi F, et al: Are there any predictive factors for successful testicular sperm recovery? Hum Reprod 1997; 12: 80-84.
36. Schlegel PN: Microsurgical techniques of epididymal and testicular sperm retrieval. Atlas of Urol Clin North Am 1999; 7: 109-113.
37. Devroey P: ICSI with testicular sperm: techniques for retrieval in obstructive and nonobstructive azoospermia. Treatment of infertility: the new frontiers. (Filicori M, Flamigni C, ed). New Jersey, Communications media for education, 1998.
38. Aydos K: Testiküler sperm ekstraksiyonu ile spermatozoa elde etmede mikrocerrahi yöntem ve çoklu biyopsi alma yönteminin karşılaştırılması. Üroloji Bülteni 2001; 12: 181-184.
39. Crabbe E, Verheyen G, Tournaye H, Van Steirteghem A: The use of enzymatic procedures to recover testicular germ cells. Hum Reprod 1997; 12: 1682-1686.
40. Blanchard Y, Lavault MT, Quernee D, et al: Preparation of spermatogenic cell populations at specific stages of differentiation in the human. Mol Reprod Dev 1991; 30: 275-279.
41. Aslam I, Robins A, Dowel K, Fishel S: Isolation, purification and assessment of viability of spermatogenic cells from testicular biopsies of azoospermic men. Hum Reprod 1998; 13: 639-643.
42. Aydos K: Nonobstrüktif azoospermi olgularında mikroskopik TESE: mekanik ve enzimatik ayrıştırma yöntemlerinin karşılaştırılması. Klinik Bilimler Cerrahi Dergisi 2001; 7: 636-640.
43. Crabbe E, Verheyen G, Silber S,et al: Enzymatic digestion of testicular tissue may rescue the intracytoplasmic sperm injection cycle in some patients with non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 1998; 13: 2791-2795.
44. Fischer R, Baukloh V, Naether OGJ, et al: Pregnancy after intracytoplasmic sperm injection of spermatozoa extracted from frozen-thawed testicular biopsy. Hum Reprod 1996; 11: 2197-2201.
45. Meistrich M, Brock WA, Grimes SR, et al: Nuclear protein transitions during spermatogenesis. Fed Proc 1978; 37: 2522-2526.
46. Perreault SD, Naish SJ, Zirkin BR: The timing of hamster sperm nuclear decondensation and male pronucleus formation is related to sperm nuclear disulfide bond content. Biol Reprod 1987; 36: 239-243.
47. Kimura Y, Yanagimachi R: Mouse oocytes injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring. Development 1995; 121: 2397-2401.
48. Aslam I, Fishel S. Short-term in-vitro culture and cryopreservation of spermatogenic cells used for human in-vitro conception. Hum Reprod 1998; 13: 634-637.
49. Kimura Y, Yanagimachi R. Development of normal mice from oocytes injected with secondary spermatocyte nuclei. Biol Reprod 1995; 53: 855-859.
50. Ogura A, Wakayama T, Suzuki O, Shin TY, Matsuda J, Kobayashi Y: Chromosomes of mouse primary spermatocytes undergo meiotic divisions after incorporation into homologous immature oocytes. Zygote 1997; 5: 177-181.
51. Aydos K: İn vitro sperm maturasyonu. Klinik Androloji. Özdiler E, Aydos K (ed), Ankara Üniversitesi Basımevi, Ankara, 2000.
52. Weiss M, Vigier M, Hue D, Perrard-Sapori MH, Marret C, Avallet O, Durand P: Pre- and postmeiotic expression of male germ cell-specific genes throughout 2-week cocultures of rat germinal and Sertoli cells. Biol Reprod 1997; 57: 68-72.
53. Parvinen M, Wright WW, Phillips DM, Mather JP, Musto NA, Bardin CW: Spermatogenesis in vitro: completion of meiosis and early spermiogenesis. Endocrinology 1983; 112: 1150-1154.
54. O’Brien DA. Stage-specific protein synthesis by isolated spermatogenic cells throughout meiosis and early spermiogenesis in the mouse. Biol Reprod: 1987; 37: 147-151.
55. Jager S, Kremer J: Immunological aspects of male infertility. Ann Biol Clin 1987; 45: 340-345.
56. Nakamura M, Romrell LJ, Hall PF. The effects of temperature and glucose on protein biosynthesis by immature (round) spermatids from rat testes. J Cell Biol 1978; 79: 1-5.
57. Tsirigotis M: In vitro maturation of human testicular spermatozoa. Treatment of infertility: the new frontiers. Filicori M, Flamigni C (eds), 393-401, Communications media for education. New Jersey, 1998.
58. Tesarik J, Greco E, Rienzi L, Ubaldi F, Guido M, Cohen-Bacrie P, Mendoza C: Differentiation of spermatogenic cells during in-vitro culture of testicular biopsy samples from patients with obstructive azoospermia: effect of recombinant follicle stimulating hormone. Hum Reprod 1998; 13: 2772-2776.
59. Jutte N, Jansen JR, Grootegoed J, et al: Regulation of survival of rat pachytene spermatocytes by lactate supply from Sertoli cells. J Reprod Fertil 1985; 62: 399-403.
60. Elder K, Elliot T: The use of testicular and epididymal sperm in IVF: culture of testicular sperm. World wide conferences on reproductive biology. P: 46-49, Ladybrook pub, MAD print and delivery, Morley, West Australia 6062, 1998.
