Kaan AYDOS
İnfertil çiftler arasında erkek faktörü, olguların yaklaşık olarak %50’sinde sorumlu tutulmaktadır (1). Özellikle son yıllarda moleküler biyoloji alanında kaydedilen ilerlemeler, daha önce klasik sperm analizi ile normal bulunmasına rağmen, infertilite nedeni olabilecek ya da en azından fertilizasyon bozukluğuna katkıda bulunabilecek başka faktörlerin de mevcut olabileceğini ortaya koymuştur. Örneğin sperm DNA kırıkları bu konuda üzerinde en çok çalışılan patoloji durumundadır. Sigara, çevresel toksikler, oksidatif stres gibi sık karşılaşılan bir çok faktör DNA hasarından sorumlu tutulmuşlardır. Diğer yandan, spermin kapasitasyonunda membrandan kolesterolün uzaklaştırılmasının önemi anlaşıldıkça, kolesterol bağlayıcı albuminin sperm hazırlama solüsyonlarındaki konsantrasyonu da in vitro fertilizasyon (IVF) ve intrauterin inseminasyon (IUI) uygulamalarında önem kazanmıştır. Serum testosteron/östradiol oranında dengesizlikle karakterize bir endokrinopati de son zamanlarda ayrı bir etyolojik neden olarak önerilmektedir.
Bütün bu ve benzer nedenler ile, gerek spontan gebelik beklenmesinde gerekse üremeye yardımcı tekniklerin kullanılacağı infertilite tedavisinde erkeğin tetkiki ve değerlendirilmesi bir gereksinim haline gelmektedir. İnfertilite nedeniyle başvuran çiftlerin ilk arzusu fizyolojik yoldan çocuk sahibi olabilmeleridir. Erkekte tedaviyi takiben fizyolojik yoldan eşlerinde gebeliğin sağlanabileceği birçok düzeltilebilir faktör bulunmaktadır: enfeksiyon, antisperm antikor varlığı, inflamasyon, ereksiyon ve ejakulasyon bozuklukları, penisin anatomik defektleri, parsiyel ya da komplet obstrüktif nedenler, varikosel, skrotal patolojiler, hormonal bozukluklar, koruyucu amaçla inmemiş testisin düzeltilmesi, çevresel faktörler, toksik madde kullanımı bunlar arasında sayılabilir. Bunların tedavisi ancak konunun uzmanı androloglar tarafından yapılabilir. Yine de, olguların önemli bir kısmında fizyolojik yollardan çiftin çocuk sahibi olması mümkün olamamaktadır. O zaman üremeye yardımcı tekniklerin (ÜYT) kullanılması gerekir. Günümüzde ÜYT’in kullanılması ile erkek faktörü infertilite olgularında sorun yüksek oranda çözümlenebilmektedir. ÜYT, erkek infertilitesinde önemli bir yer oluşturmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar göstermiştir ki, in vitro şartlarda fertilitenin sağlanmasında germ hücrelerinin oluşum ve maturasyon evrelerinde yapılacak iyileştirmeler, başarıyı önemli ölçüde artıracaktır. Sperm membran yapısındaki ultrastrüktürel defektlere neden olabilecek faktörlerin tedavi edilmeleri (örneğin varikoselin tedavisi ya da oksidatif stresin eliminasyonu) ÜYT’de sperm-oosit etkileşiminde başarı oranlarını belirgin derecede yükseltebilir. O nedenle, tek başına gametin tedavi edilmesinin yanısıra, gametlerin in vivo tedavilerinin de sağlanması son derece önem kazanmaktadır.
ÜYT‘de son yıllarda kaydedilen çarpıcı ilerlemeler ortaya koymuştur ki, in vitro fertilizasyon (IVF-ET) uygulamalarında %20’nin üzerinde, intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) uygulamalarında ise yaklaşık %80 olguda endikasyon erkek faktörüdür. Erkek faktörü infertilite olgularında ÜYT’in önemli yeri olduğu yapılan birçok çalışmada da vurgulanmıştır. Yamamoto ve ark., oligoastenoteratozoospermi (OAT) bulunan ve IVF-ET uygulamalarından fayda görmemiş 13 varikosel olgusunda, varikosel operasyonunu takiben %31 oranında gebelik görüldüğünü bildirmiştir (2). Dubin ve ark. ise kendi çalışmalarında benzer olgularda erkekte tedaviye hCG’nin eklenmesinin gebelik oranlarını % 27’den %45’e çıkaracağını göstermiştir (3). Diğer yandan, testiküler sperm ekstraksiyonu (TESE) ve mikrocerrahi ile epididimal sperm eldesi (MESA) gibi yeni tekniklerin kullanılmaya başlanılması da obstrüktif / nonobstrüktif azoospermi olgularının ya da konjenital bilateral vaz agenezi (CBAVD) olgularının ayırt edici tanılarında dikkatli bir androlojik araştırmayı gerekli kılmıştır. Varikosel ve testis tümörleri gibi diğer patolojilerin teşhisi de ancak erkeğin dikkatli bir fizik muayenesi ile yapılabilir. İnfertilite olgularında etyolojiye yönelik kriptorşidizm ya da çevresel toksik ajanlar gibi risk faktörlerinin ortaya konulmasında erkeğe ait tıbbi hikaye, yeterli bir androlojik muayenenin önemini vurgular niteliktedir.
Erkek faktörünün sorumlu olduğu infertilite olguların tedavisinde ÜYT’in kullanılması veya tedavi edilebilir patolojilerin tanısı konularak erkekteki bozukluğun spesifik olarak düzeltilmesi arasında bir tercih yapılmasında, ekonomik faktörler de ön plandadır. Örneğin, ABD’de varikoselektomiyi takiben spontan gebelik elde edilmesi ve doğurtulmasının maliyeti 26.000 $ iken, bunlara ICSI uygulanmış olması durumundaki maliyet ise 89.000 $ olarak bulunmuştur (4). Çalışmaya göre gebelik oranları ise varikosel ve ICSI ile yapılan doğumlar için sırasıyla %30 ve %28 olup, belirgin bir fark göstermemektedir. Bununla birlikte, spermlerin akrozin aktivitesi, akrozom reaksiyonu ya da zonaya bağlanma gibi fonksiyonlarının bozulduğu olguları da IUI veya IVF-ET ile tedavi etmeye çalışmak gerek maliyet gerekse zaman bakımından boşuna kayıplara neden olacaktır. Bu gibi olgularda ÜYT’de tercih edilecek tek tedavi yöntemi ICSI’dir.
Üremeye yardımcı teknikler (ÜYT) ünitesinde bir androloji uzmanının özellik gösteren görevleri aşağıda yazılmıştır:
a) İnfertil Erkekte Tedavi Alternatiflerinin Değerlendirilmesi ve ÜYT’lerin Kullanılmasına Karar Verilmesi: İnfertilite nedeniyle tetkik edilen çiftlerde ÜYT’in kullanılmasına karar verilmesinde erkek faktörünü düzeltebilecek ve fizyolojik yollardan gebeliği sağlayabileceği şartları kazandıracak her türlü diğer tedavi alternatifleri gözden geçirilmelidir.
Daha önce azoospermi nedeniyle takip edilirken TESE – ICSI uygulanmasına karar verilmiş bazı erkekler transrektal ultrasonografi (TRUS) ile değerlendirildiğinde ejakulatör kanallara bası yapan ve azoospermiye neden olan bir orta hat kistine rastlanılabilir. Kistin USG eşliğinde transrektal yolla boşaltılması sperm parametrelerini normale döndürerek spontan gebelik şansı elde edilebilir. Daha önce belirtildiği gibi Yamamoto, IVF-ET yapılan ve başarısız olunan 13 olguda daha sonra varikosel operasyonu yapılmasını takiben IVF-ET tekrar denendiğinde %31’inde gebelik elde edildiğini bildirmiştir (2). Azoospermi ya da ileri derecede OAT bulunan erkeklerde eğer obstrüktif bir etyoloji teşhis edilebilirse, bunlara mikrocerrahi yöntemle vazoepididimostomi yapılmasını takiben %43’e varan oranlarda spontan gebelik sağlanabilmektedir (5). Torok, plasebo kontrollü 27 infertil erkeğin tedavi edildiği bir çalışmasında, 3 ay süreyle günde 20 mg Tamoxifen kullanmış ve seminal parametrelerinde anlamlı düzelme, %33 oranındada gebelik bildirmiştir (6). Plasebo kontrollü ve randomize beş çalışmanın meta-analiz sonuçlarını bildiren bir başka çalışmada ise, oral kallikrein kullanımının gebelik oranlarını anlamlı derecede artırdığı gösterilmiştir (7). Astenozoospermik infertil 51 erkekte de serbest oksijen radikallerinin araştırılmasını takiben, oral vitamin-E kullanımının spermatozoada malondialdehyde düzeyini anlamlı derecede düşürerek zararlı antioksidan etkiyi azalttığı ve neticede plasebo alan olgularda %0 olmasına karşın, tedavi gören hastalarda %21 oranında spontan gebelik elde edildiği gözlenmiştir (8).
Bütün bu sonuçlar, erkek faktörünün detaylı bir değerlendirime tabi tutulduğunda ya da belirli bir süre tedaviye alındıklarında, bazı infertilite olgularında ÜYT’e gerek kalmadan spontan gebeliğin elde edilebileceğini, bu şekilde gereksiz yere kadının hormonal veya girişimsel manipülasyonlarına gerek kalmayacağını , ayrıca ekonomik yönden de koruyucu olunabileceğini açıkça ortaya koymaktadır. O halde, infertil çiftlerde ÜYT kararı verilirken tam bir androlojik değerlendirim’e gereksinim vardır. Ancak bütün tetkikler yapılıp başka tedavi seçeneği kalmadığı anlaşıldıktan ve belgelendikten sonra tedaviye geçilmesi uygun olur.
b) ÜYT Uygulanacak Çiftlerde Erkeğin Muayene Edilmesi ile Hayatı Tehdit Eden Hastalıkların Saptanması: Çeşitli hastalıklar erkekte spermatogenez ya da ejakulasyon ve penil ereksiyonu bozarak infertiliteye yol açabilirler. Bir çok sistemik hastalığın spermatogenez üzerine doğrudan zararlı etkisi olduğu bilinmektedir. Her ne kadar infertilite, ciddi hastalığı olan erkeklerde fazla önemsenen bir faktör değilse de, bazı hastalıkların ilk belirtisi üreme fonksiyonlarında bozulma olabilir. Burada infertil erkeği muayene eden hekimin bu hastalıklar konusunda yeterli bilgiye sahip olması, en azından şüphelenerek gerekli muayene ve tetkikleri yapması gerekir.
İnfertilite ile birlikte seyreden hastalıklar genel olarak 3 grupta toplanabilir (9).
1) Endokrin bozukluklar: Üreme fonksiyonlarının ve cinsel fonksiyonların normal olarak devam edebilmesi sağlam bir hipotalamus – hipofiz – testis aksının varlığına bağlıdır. Hormon salgılayan tümörlerin bu aks üzerine ters etkileri ya da nonfonksiyonel tümörlerin yaptıkları basılar neticesinde üreme fonksiyonları bozulabilir. Hiperprolaktineminin ise, tümörün hipofizde LH ve FSH salgılayan hücreler üzerine direk bası yaparak ya da hipotalamustan GnRH salgılanmasını inhibe ederek veya periferik hedef androjen dokularını etkileyerek fertiliteyi engellemesi mümkündür. Aşırı androjen salgılayan hastalıklarda da hipofiz – hipotalamus üzerine artmış feed-back etkiyle gonadal fonksiyonlar bozulabilmektedir (Tablo 1).
Hipofiz tümörleri
SSS tümörleri
Adrenal karsinom
Konjenital adrenal hiperplazi
Leydig hücreli tümör
Klinefelter sendromu
Androjen dirençli hastalıklar
Kalmann sendromu
Tablo 1. Endokrin sistemi etkileyerek infertilite ile birlikte seyredebilen medikal hastalıklar.
2) Spermatogenez bozukluğu ile birlikte seyreden hastalıklar: Spermatogenez, haploid genotipte germinal hücrelerin yapıldığı, mitoz ve mayoz bölünmelerin birlikte seyrettiği kompleks bir proçestir. Bu işlem sağlam bir nöroendokrin etkileşimi gerektirir. Ayrıca, yeterli nutrisyonel bir ortamın sağlanmış olması ve vücut ısısından daha düşük bir ısı da şarttır. Bu proçes bir çok medikal hastalık ya da anomali neticesi bozulabilir ve infertilite ortaya çıkabilir.
Testislerin maliğn tümörlerine infertil hasta grubunda daha sık rastlanılabilmektedir. Ayrıca, testis kanserli çoğu erkekte tedaviye başlamadan önce sıklıkla fertilite de bozulmuştur. İnmemiş testis olgularında gerek infertilite gerekse testis tümörü gelişme sıklığı normalden oldukça fazladır. Tek taraflı inmemiş testis bulunan olguların %30’unda infertilite bulunması bu patolojinin bilateral etkisini vurgular niteliktedir. Genel populasyonda %10-20 oranında rastlanılan varikoselin sıklığı infertil erkekler arasında %30-40’a çıkmaktadır. Testis tümörü ve inmemiş testis olgularında da rastlanıldığı gibi, tek taraflı varikoselin bilateral testis fonksiyonlarında bozulma yapması mümkündür. Sağ tarafta ortaya çıkan bir varikosel hekimi testiküler venöz dönüşü engelleyen bir retroperitoneal hastalık konusunda uyarmalıdır. Özellikle retroperitoneal lenfoma ve sarkomlar ile büyük böbrek kanserleri ilk akla gelmelidir. Kartagener sendromu gibi sistemik bir hastalığın varlığı da spermatogenezi bozmuş olabilir. Spermatozoanın flagellumu ile solunum yollarındaki flagellaların mikrotubuli yapıları birbirleriyle aynıdır. Bu nedenle, total sperm motilite bozukluğu olgularında bu patoloji de akla gelmelidir (tablo 2).
Testis tümörleri
Retroperitoneal tümörler (varikosel yaparak)
İnmemiş testis
Kartagener sendromu
Tablo 2. Spermatogenezi etkileyen medikal hastalıklar.
3) Ejakulasyon bozuklukları: Nöromuskuler bir işlev olan ejakulasyon, aynı zamanda sağlam bir sperm taşıyıcı kanal sisteminin varlığını da gerektirir. Bu işlem otonom sempatik sinir sistemi (T10-L2) ve somatik sinir sistemi (S2-4) sayesinde işler. Bunlarda bozukluk yapan anatomik defektler ile otonom ve somatik sinir sistemi bozuklukları infertilite nedeni olabilirler (tablo 3).
Diyabet mellitus
Multiple skleroz
Spinal kord travmaları
Retroperitoneal operasyonlar
Nörotoksik ilaçlar
Vaz agenezi ile birlikte olan kistik fibrozis
Young sendromu
Genitoüriner anomaliler
Tablo 3. Ejakulasyonu etkileyen medikal hastalıklar.
Yukarıda sayılan hastalıklar infertil erkeklerde nadir görülmekle birlikte ortaya çıktıkları zaman hayati önem taşımaktadırlar. Özellikle erken tanı konularak tedaviye gidilmeleri şahıs için bir şanstır. Günümüzde ÜYT’deki ilerlemeler infertil erkeğin araştırılmasında çoğu kez yeterli bir muayenenin yapılmasının ihmal edilmesine neden olmuştur. Tecrübesiz hekimler ya da konunun uzmanı olmayanlarca hastanın değerlendirilmesi, bu hastalıkların gözden kaçması ve tanıda gecikmelerle sonuçlanabilir. Buda bize tek başına bir spermiyogram ile hastanın takip edilmesi durumunda, eşlik eden ve hayati tehlikeye sahip olabilecek önemli hastalıkların teşhis edilemiyeceğini göstermektedir. Bu nedenle erkek faktörü infertilite ile baş vuran bütün erkekler bir üro- androloji uzmanı tarafından komple değerlendirimden geçirilmelidir.
c) ÜYT Uygulanacak İnfertil Çiftlerde Erkeğin Hazırlanması:
1992 yılında ICSI’nin kullanıma girmesiyle birlikte, erkek infertilitesinin tedavisinde de yeni bir dönem başlamış oldu. Daha önce çocuk sahibi olamayan çiftlerin önemli bir kısmında sağlıklı gebelikler başarılabilir hale gelmiştir. Eğer spesifik tedaviler ile başarılı olunamamış ise, ICSI faydalı bir alternatif olarak düşünülmektedir. Bununla birlikte ICSI beraberinde genetik risk faktörlerini de gündeme getirmiştir.
Şiddetli oligozoospermi ve azoospermili erkeklerin önemli bir kısmında neden genetik temele dayanmaktadır. Sıklıkla 3 çeşit genetik bozukluk erkekte infertilite nedeni olabilir: konjenital bilateral vaz deferens agenezine (CBAV) yol açan kistik fibrozis transmembran regülatör (CFTR) gen mutasyonları, Y- kromozom mikrodelesyonları, ve Klinefelter sendromu gibi karyotip bozukluklar. CBAV‘li erkeklerin %80’inde CFTR geninde mutasyona uğramış en az bir allel bulunur. ÜYT’e geçmeden önce hem erkek hem de kadında kistik fibrozis için mutasyona uğramış genlerin araştırılması şarttır. CBAV’li erkeklerin %20’sinde ise CFTR mutasyonu bulunamaz ve bunlar ya tanımlanamamış mutasyonlara sahiptirler ya da farklı bir etyoloji söz konusudur.
Azoospermik erkeklerin %16’sında kromozom anomalileri söz konusu olup, bunun da %13’ünü Klinefelter sendromu oluşturur. Oligozoospermili erkeklerde ise karyotip anomalileri görülme sıklığı %5-6 arasında olup, çoğu otozomal Robertsonian ve resiprokal translokasyonlardır. Somatik karyotip normal bulunmuş olsa bile, hasta yüksek oranda anöploidi taşıyan spermatozoa çıkarabilir. Yapılan çalışmalar, TESE ile elde edilen spermlerde ve şiddetli oligoastenoteratozoospermi olgularında anöploidi ve diploidi oranlarının normallerden yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Böyle spermler kullanılarak yapılan ICSI uygulamaları sonucu doğacak çocuklarda anöploidik doğum riski her zaman akılda tutulmalıdır.
Y kromozom delesyonuna azoospermi olgularının %10-20’sinde, şiddetli oligozoospermilerin ise %5-6’sında rastlanılmaktadır. Bu defektin ICSI ile erkek çocuğa da geçme riski söz konusudur.
Spermatogenezde androjenler, özellikle testosteron esastır. Androjenlerin fonksiyonları androjen reseptörleri tarafından idare edilir. Androjen reseptör geninin 1 numaralı eksonu üzerinde iki tane son derece polimorfik CAG ve GGN mikrosatellit dizeleri bulunur. Kennedy hastalıklı erkeklerde CAG dizesinin tekrar sayısı 40’ı aşmakta olup, neticede androjen reseptör mutasyonu ortaya çıkar. Kennedy hastalığı ise X’e bağımlı bir tür spinobulber musküler atrofi durumudur. İnfertil erkeklerde CAG tekrar sayısı ile sperm sayısı arasında bir ilişkinin bulunabileceği ileri sürülmüş olmakla birlikte aksi veriler de mevcuttur. Her ne olursa olsun, bazı trinukleotid dizelerinin uzaması nöromusküler hastalık, spino-bulber musküler atrofi veya Kennedy hastalığı için risk getirmektedirler. Androjen reseptör geni Xq11-12 numaralı X kromozomu üzerinde bulunduğundan, CAG trinukleotid tekrar dizelerinin Kennedy hastalığını ICSI sonrasında ileri nesillere geçirme riski bildirilmiştir (63). Bu konunun araştırılarak ailelere bildirilmesi önem gösterir.
İşte bütün bu nedenler göz önüne alındığında, üremeye yardımcı teknikler uygulanacak çiftlerde androlog tarafından erkeğe ait risklerin aileye izah edilmesi ve gerekli testlerin yapılması son derece önemlidir. Aksi takdirde gerek tıbbi gerekse legal bazı sorunlarla karşılaşılabilir.
Erkek faktörü infertilite olgularında ÜYT tedavinin önemli bir kısmını oluşturmaktadır. ÜYT uygulanacak erkeklerde bu işlemlerin başarısını artırmak için bazı hazırlıkların yapılması gereklidir. Burada amaç seminal parametrelerde kantitatif bir düzelmenin yanı sıra, kalitatif özelliklerde bir iyileşmenin de sağlanmasıdır. Sperm değerlerinde kantitatif ve kalitatif düzelme sağlayabilecek bu uygulamalar ancak doğru endikasyonla uygulandıklarında başarılı olurlar.Örneğin patolojik değerlerde lökospermi yoksa, gereksiz yere antiinflamatuvar kullanılması, tüm lökositlerin ortamdan çekilmesine ve neticede fagositotik aktivitenin bozularak dejeneratif hücre sayısında artışa, bu da aşırı ROS üretimine yol açabilecektir. Aşağıda bu konunun önemini vurgulamak amacıyla lökospermi, enfeksiyon, immünolojik infertilite ve oksidatif stres ürünleri (ROS) gibi bazı noktalara dikkat çekilmiştir.
Lökosperminin tanımı yapıldığında; WHO kriterlerine göre semende 1 milyon/ml’ den fazla lökosit görülmesi patolojiktir (10). Ancak, immatür germ hücrelerinin lökositlerden ayırt edilmesi gerekir. Monoklonal antikor tekniği (11) ya da peroksidaz boyası (12) bu ayrımı yapmada sık kullanılan yöntemlerdir. Lökosperminin üreme fonksiyonları üzerine etkisi sperm sayı, motilite ve morfoloji bozukluğu, postkoital test ve in vitro mukus penetrasyonunda negatif etkileridir (13). Ayrıca, in vitro fertilizasyonda da prognostik faktör olarak öneme sahiptir. Her ne kadar bakteriyal ya da viral enfeksiyonlarla birlikte görülebilirse de, olguların %80’inde bakteriyolojik testler negatif çıkmaktadır (14). Burada hücresel immünite rol oynuyor olabilir (15).
Sigara içimi gibi çevresel faktörler, anormal spermatogenez, uzun cinsel perhizler, ya da varikosel lökospermiye neden olabilir. Lökositlerin fertilizasyon bozukluğu yapmasındaki patofizyolojik faktörler arasında sitokinler (-interferon, TNF-), reaktif nitrojen aracıları ve serbest oksijen radikalleri sayılabilir (16). Bunların yanı sıra lökositler, HIV, sitomegalo virüs ya da klamidya gibi patojenleri taşıyarak da seksüel geçiş gösteren hastalıkların yayılmasında etken olabilir. Bütün bu nedenlerden dolayı lökosperminin giderilmesinden sonra ÜYT’in uygulanmasına geçilmesi önemli bir tedbir olarak ele alınmalıdır.
ÜYT’e karar verilen erkekte uygulama öncesinde dikkat edilmesi gereken bir diğer durum ise semende enfeksiyon bulunmasıdır. Erkek genital sisteminde en sık rastlanılan nongonokoksik enfeksiyon amili gram (-) basiller ve özellikle E. coli’dir. Genellikle semptomatik olup, bakteriüri ile birlikte seyrederler. Gram (-) basiller sperm motilitesi ve canlılığı üzerine olumsuz bir etkiye sahiptir. Spermatozoada aglütinasyona yol açarlar. Genital bezlerin bu mikroorganizmalar ile enfekte olmaları bunların sekresyonlarını da bozarak sperm fonksiyonlarını etkileyebilir. Birlikte bulunan lökositlerinde oksidatif strese ve sitotoksik sitokinlere bağlı olarak sperm sayı, motilite ve morfolojisinde bozulma yapmaları da mümkündür. Klinik olarak bakteriyel enfeksiyon bulunan erkeklerde antibiyotik tedavisini takiben seminal parametrelerde ve fertilitede düzelme elde edilebilir. Diğer yandan, infertil erkeklerin önemli bir kısmında asemptomatik enfeksiyon bulunabileceği de unutulmamalıdır (17). Ancak, genital sistemin subklinik enfeksiyonlarının infertilitedeki rolü kesin değildir. Semptomların yokluğu, seminal plazmanın antibakteriyal etkisi, uretral mikroorganizmalarla kontamine olmaları ve bütün potansiyel patojenlerin kültürlerindeki güçlükler nedeniyle subklinik genital enfeksiyon tanısı koymak güçtür. Klinik enfeksiyon belirtisi vermeyen infertil erkeklerin sperm kültürlerinde %83’ünde üreme bildirilmiştir (18).
Ureaplasma urealyticum, asemptomatik erkeklerin uretrasından sıklıkla izole edilebilir. Fertil erkeklerin semen kültürlerinde %23 oranında ürerken, infertillerde bu oran %85′ e çıkmaktadır (19). Ureaplasma sperm fonksiyonlarını, motilitesini ve fertilizasyon kapasitesini bozarak infertiliteye neden olur. Ureaplasmaya maruz kalmış spermlerin SPA sonuçları anlamlı derecede düşmektedir (20). Ureaplasma urealyticumun tetrasiklin ile tedavisini takiben %60 gebelik oranları bildirilmektedir (21). Oysa bu ajanın sebat ettiği olgularda gebelik oranları % 5 civarında kalmaktadır. Benzer şekilde, klamidya trakomatis ile enfekte erkeklerin de %10-25’i asemptomatiktir. Bu mikroorganizmaların immünolojik olarak seminal parametreleri süprese ettiği gösterilmiştir (22). Bütün bu veriler, infertil erkeklerin araştırılmasında subklinik enfeksiyonların önemini vurgular niteliktedir. İn vitro fertilizasyondaki negatif etkileri, lökospermi ve buna bağlı sitotoksik ajanların ortama geçmesi ile immünolojik sonuçları nedeniyle, spesifik olarak mikroorganizma üretilen ya da lökospermi saptanan olgularda enfeksiyonun tedavisi özellikle düşünülmesi gereken bir konudur.
Üçüncü önemli husus ise semende immün sistem hücrelerinin bulunmasıdır. İnfertil çiftlerin yaklaşık %4-20’sinde immünolojik nedenler bulunmaktadır. Antisperm antikorlar (ASA) serumda, seminal plazmada, spermatozoa yüzeyinde ya da servikal mukusta bulunabilirler. Bunların fertilite üzerine etkileri sperm motilitesini bozarak, sperm ölümüne neden olarak, sperm-mukus penetrasyonunu bozarak, kapasitasyon ve akrozom reaksiyonunu etkileyerek ya da sperm-oosit etkileşimini bozarak olur (23). İki tip ASA tanımlanmıştır: immobilize edici sitotoksik ASA ve aglütine edici ASA. Özellikle sperm başı üzerinde lokalize olduklarında fertilizasyonu etkileyebilmektedirler. Bununla birlikte, bütün immünolojik infertilite olguları ASA varlığı ile izah edilememektedir.
Sperm antijenlerine karşı gelişen total immün yanıtta ASA’ların rolü ancak küçük bir orandadır (15). Daha büyük kısmını hücresel immün sistem ve buna bağlı sitokin yapımı oluşturmaktadır. Sperm antijenlerine maruz kalan T- lenfositlerin aktive olarak ortama -interferon gibi sitokin salgıladıkları gösterilmiştir. Neticede, ortama çıkan kemotaktik faktörler makrofajların, granülositlerin ve diğer dejeneratif hücrelerin de gelmesine neden olarak fagositoz, opsonizasyon ve liyzis ile germ hücrelerinde hasar oluştururlar. Lökosperminin görüldüğü inflamatuvar olaylarda fertilitenin bozulacağı yukarıda izah edilmişti. Benzer şekilde, spermlerin rekombinan -interferon’a maruz kalmalarının da hamster yumurtalarında penetrasyon bozukluğuna yol açacakları ortaya konulmuştur (24). Ayrıca, immün hücreler ortamda serbest oksijen radikallerinin de artmasına sebep olurlar. Humoral immüniteyi ortaya çıkaracak MAR (mixed antiglobulin reaction) ve IMB (immunobead test) gibi kolay ve güvenilir testler geliştirilmiş olmakla birlikte, hücresel immüniteyi teşhis etmek henüz rutin uygulanıma girmemiştir. Bu amaçla agarose jel lökosit migrasyon testi ileri sürülmüştür (25).
ASA’lar tespit edildiğinde immunosupresyon ya da ÜYT kullanılarak tedavi edilebilirlerse de, tanısındaki güçlükler gözönüne alındığında, hücresel immünite için antiinflamatuvar tedavi ya da immunosupresyon ancak ampirik olarak uygulanabilir. Sonuç olarak, IUI veya IVF-ET uygulanacak erkeklerde lökospermi gibi immünolojik faktörlerin elimine edilmeleri başarılı bir tedavi için açıkça gerekli koşullar olarak görülmektedir. Bu nedenle üzerinde özellikle durulması gerekli bir faktördür.
Lökosit ve immatür germ hücrelerinden salınan reaktif oksijen türevleri (ROS) sperm plazma membranındaki poliansature yağ asitlerinde peroksidasyon yaparak, membran yapılarında bozulmaya yol açabilirler (26). Spermatozoalar çok miktarda doymamış yağ asitleri içerdikleri ve superoksid dismutaz ya da glutathione peroksidaz gibi koruyucu enzimlerden nispeten fakir olduklarından, bu hasara özellikle duyarlıdırlar. Neticede, sperm motilitesinde bozulma, akrozom reaksiyonunda yetersizlik ve bunlara bağlı olarak sperm-oosit füzyonunda bozulmalar meydana gelir.
Alpha-tocopherol (E vitamini) peroksidatif atakları önleyen antioksidan bir ajan olarak infertil erkeklerde kullanılmış ve değişik sonuçlar bildirilmiştir. Seminal parametreler üzerinde düzeltici bir etkisi bulunmadığını bildiren çalışmaların yanı sıra (62), plasebo kontrollü çift kör çalışmasında Suleiman ve ark., 6 aylık E vitamini tedavisini takiben sperm motilitesinde ve gebelik oranlarında anlamlı artış bulmuştur (8).
d) ÜYT’de Kullanılacak Sperm Hücre Fonksiyonlarının Değerlendirilmesi: Bir infertilite olgusunun tedavisinde amaç; sperm ve oositin gerektiği şekilde birleşerek fertilizasyonunun sağlanması ile oluşacak embriyonun normal implantasyonu ve devamında sağlıklı bir gebelikle çocuğun doğmasıdır. Burada androloğun rolü bozulmuş fertilizasyon proçesi içinde hangi kademede problemin geliştiğini ortaya çıkararak, gerekli önlemleri almak ve sorunu tedavi etmektir. Embriyonun implantasyonundaki bozuklukların sperme ait defektlerden de gelişebileceği ortaya konulmuştur. Özellikle, spermatozoaya ait sentrozom defektlerinin oosit fertilizasyonunda arrest oluşturduğu (27) ve kötü kaliteli spermler ile yapılan çalışmalarda embriyo gelişiminin bozulduğu ve implantasyon şansının azaldığı (28) açık olarak gösterilmiştir. Bu nedenle infertilite olayında spermin hangi evrede rol oynadığının açığa çıkarılması son derece önemlidir. Fertilizasyon kademelerini araştıran testler şunlardır (tablo 4) (29):
Servikal mukusun penetrasyonu: Postkoital test, İn vitro sperm-servikal mukus etkileşim testleri (Tru-trax, Penetrak, SCMC)
Kapasitasyon: IVF, SPA, Mannoz reseptör tayini
Akrozom reaksiyonu: IVF, SPA, Akrozom reaksiyon testleri
Zona pellusida bağlanması: IVF, HZA
Zona pellusida penetrasyonu: IVF
Oosit-sperm füzyonu: IVF, SPA
Tablo 4. Sperm’in oositi fertilizasyonu sırasında geçirdiği fizyolojik evreler ve bunları araştıran testler. IVF: in vitro fertilizasyon, SPA: sperm penetrasyon testi, HZA: hemizona testi
Androloğun yukarıda sayılan testler hakkında bilgi sahibi olması ve gerekli olgularda değerlendirime tabi tutması, uygulanacak tedaviyi de yönlendirecektir. Zona pellusidaya bağlanma defekti bulunan bir spermin IUI veya IVF-ET işlemlerine alınması hiç kuşkusuz tedavide başarısızlıkla sonuçlanacaktır. Bu olgularda doğrudan ICSI ile gebeliğin sağlanma şansının bulunduğu açıktır. Benzer şekilde, yanlış uygulamalar ancak uygun testlerin yapılması ile önlenilebilir.
e) Sperm Hazırlama Yöntemleri ve Uygun Olan ÜYT’nin Seçimi: Genelde uygulanan üremeye yardımcı teknik yöntemleri IUI, IVF-ET ve ICSI‘dir. Uygulanacak metod spermiyogram bulguları ve sperm fonksiyon testleri sonuçlarına göre seçilmelidir. 36 yaş altındaki kadınlarda 3 siklus uygulanımını takiben IUI’un başarısı >%40 dır (30). Swim up ile ejakulatın hazırlanmasını takiben >10×106/ml spermatozoa ve >%40 motilite içeren olgularda IUI ile başarılı sonuçlar alınabilir (31). Ancak, motil sperm sayısı <106 olduğu zaman gebelik oranı %3’ün altına düşmektedir. IVF için kullanılacak spermlerin ise >%30 ileri motilite ve >%30 normal morfoloji gösteren >5×106/ml spermatozoa içermesi önerilir (32). İnseminasyon dropleti içinde ise oosit başına 2×104 – 1×105/ml motil spermatozoa eklenmesi yeterlidir. Spermin kalitesine göre (immotil, aglütine, anormal spermlerde) bu sayı 5×105/ml’ye kadar yükseltilebilir (33).
ICSI için ise sperm sayısında bir kriter yoktur. Azoospermik olgularda bile testislerden elde edilen spermatozoalar, hatta spermatid kullanılarak gebelik elde edilebilmektedir. Bütün bu uygulamalarda başarılı olmanın en önemli koşullarından biri sperm hücresinin canlı olmasıdır. Oositi fertilize edebilecek kalitede bir spermi ayırt etmenin en iyi yöntemi sperm motilitesinin ve sperm membran bütünlüğünün hipoosmotik ortamda şişme (HOS) testi veya eozin- Y vitalite boyama testi ile gösterilmiş olmasıdır. Motil olmayan spermlerin canlı oldukları ortaya konmuşsa bunların kullanılması ile sağlıklı ICSI gebelikleri elde edilebilir. Oysa immotil spermlerin IUI ya da IVF gibi diğer ÜYT’de kullanılması başarılı olmayacaktır. Bu nedenle, ÜYT uygulanması kararı verilmiş olgularda, taze ejakulatın ve hastanın kliniğine göre en uygun sperm hazırlama yönteminin seçilmesi hastayı takip eden doktorun özellikle üzerinde durması gereken bir koşuldur. Örneğin, seminal parametreleri orta derecede ve ileri derecede bozulmuş erkeklerde gradiyent sistemi ile sperm hazırlanıp ÜYT uygulandığında siklus başına gebelik oranları sırasıyla %43.5 ve %7.1 bulunurken (34), swim up ile hazırlanmış örneklerde gebelik oranları ise orta kalite ejakulatlarda %5.9’da kalmaktadır. Demek ki, sperm hazırlama yöntemleri spermin kalitesine göre seçilmelidir.
f) Mikrocerrahi ile TESE ve MESA Uygulamaları: Azoospermiye erkek infertilitesi olguları arasında %10 oranında rastlanılmaktadır. Bunların büyük kısmında etyoloji testiküler yetmezliğe bağlıyken, %20’sinde bilateral obstrüksiyon sorumludur. Genel olarak değerlendirildiğinde ise infertilitede seminal kanallara ait obstrüksiyon sıklığı %7 civarındadır (35). Geçirilmiş skrotal veya inguinal operasyon ya da tekrarlayan genital enfeksiyon hikayesi bir obstrüksiyonun varlığını düşündürmelidir. Bu hastalarda testis volümü normal olup, FSH ve LH hormon düzeyleri de yine normal sınırlarda bulunur.
İnfertil erkek populasyonunun %1-2’sinde konjenital bilateral vaz deferens agenezi (CAVD) söz konusudur. İnfertilite nedeniyle tetkik edilen erkeklerin yaklaşık %20’sinde ultrasonografik veya vazovezikülografik incelemeler ile ejakulatör kanallara ait fonsiyonel ya da mekanik obstrüksiyon yapması muhtemel bir anomali saptanırken, bunların %4’ünde ejakülatör kanallarda parsiyel bir obstrüksiyonun varlığı söz konusudur (36). Ejakülatör kanal obstrüksiyonlarında ejakulatın tamamını veya büyük kısmını prostat sekresyonu oluşturur. Ejakulat volümü 0.5-1 ml, pH ise 5.5-6.5 civarındadır. Koagulasyon oluşmayıp, semende früktoz negatiftir. Bu nedenle, vaz deferenslerin palpe edildiği ama seminal volümün azaldığı ve asitleştiği azoospermi olgularında komplet bilateral ejakulatör kanal darlığından şüphelenilmelidir. Parsiyel tıkanıklıkların kliniği ise değişkendir. Ejakülatör kanal obstrüksiyonlarının tedavisinde transrektal ya da transperineal kist aspirasyonu, transuretral endoskopik rezeksiyon veya seminal kanalların yıkanması kullanılan metodlardır.
Seminal parametreleri ileri derecede bozuk olan erkeklerin %20-25’inde ise epididimal oligozoospermi bulunmaktadır (37). Bu durum, epididim içinde skar dokusu oluşumuna neden olan klinik ya da subklinik geçirilmiş enfeksiyonlara bağlanmaktadır. Skar dokusu epididimal tubulülere bası yapmakta ama bir miktar sperm çıkışına da izin vermektedir. Son yıllarda seksüel geçiş gösteren hastalıkların artması ile bu oranın daha da yükselmesi beklenmektedir. Geniş serili çalışmalarda, sperm konsantrasyonunun 5 milyon/ml’den düşük, %20’den az motilite ve %25’in altında normal formda sperm bulunan olguların %49’unda testis biyopsilerinde normal spermatogenez saptanırken epididimal bir patoloji de eşlik etmektedir. Spermatogenezin ve epididimlerin her ikisinin de normal olduğu olgular sadece %4 oranındadır. Geri kalanlarında ise spermatogenezde bir bozukluk söz konusudur. Epididimal oligozoospermi olgularının tedavisi mikrocerrahi olup, epididimolizis ya da vazoepididimal anastomozlar uygulanabilir. Sonuçları oldukça başarılıdır. Değişik etyolojilere bağlı gelişebilen vazal ya da epididimal obstrüksiyonların mikrocerrahi ile tedavileri neticesi %38-96’sında anastomoz açıklığı ve %19-82 arasındada spontan gebelik oranları bildirilmektedir (38). Sonuçlardaki değişkenlik obstrüksiyonun seviyesi ve süresi, epididim fonksiyonları, tekrarlayan genital enfeksiyonların varlığı ve antisperm antikor gelişimine bağlanabilir.
Obstrüktif azoospermi olgularında yukarıda bahsedilen tedavileri takiben bir düzelme sağlanamamışsa üremeye yardımcı teknikler kullanılmalıdır. Ejakulattan yeterli sayı veya kalitede sperm elde edilemediği olgularda testisden ya da epididimden alınan spermler ICSI işleminde kullanılarak olguların sırasıyla % 33.3 ve %44.3’ünde gebelik sağlanılabilir (39).
Nonobstrüktif azoospermi‘ye ise değişik faktörler yol açabilir: maturasyon arresti, germinal aplazi (Sertoli cell only sendromu), kriptorşidizm,
kemoterapi veya Klinefelter sendromu bunlar arasında sayılabilir. Testiküler yetmezlikli bu olguların yaklaşık %50’sinda testislerden spermatozoa ekstrakte edilebilmektedir (40). Geri kalanlarında ise yuvarlak spermatid nukleusu (ROSNI) veya değişik evrelerde spermatidler kullanılarak ICSI yapılabilmektedir (41). ICSI’de kullanılabilecek en ideal spermatid evresi uzamış (elongated) ve matür spermatidlerdir (42). Bununla birlikte, uzamakta olan (elongating) ya da yuvarlak spermatidler kullanılarak da fertilizasyonun başarılması mümkündür.
Hoffman veya Nomarski optikleri kullanılarak bile haploid yuvarlak spermatidleri diploid spermatositlerden, spermatogoniumlardan, lökositlerden, eritrositlerden ya da Sertoli hücre nukleusundan ayırt etmek her zaman kolay olmamaktadır. Bu amaçla bazı kriterler getirilmiştir (43). Yuvarlak spermatidlerin daha küçük olmaları (6.5-8 ) ve çıkıntı yapmış akrozom veziküllerinin görülmesi, belirgin nukleusları ile bunu çevreleyen sitoplazma zonu bunların spermatogoniumlardan, spermatositlerden ya da lenfositlerden ayırt edilmesinde yardımcı bazı kriterlerdir. Bununla birlikte, ikinci mayoz bölünmesini yeni tamamlamış bir spermatidde henüz akrozom yapısı gelişmediği için, Golgi fazı spermatidleri özellikle küçük lenfositlerle karışabilmektedir. Belirgin nukleolusu ve transparan, düz sınırlı görünümleri ile Sertoli hücre nukleuslarını görebiliriz. Bütün bu kriterlere rağmen bir yuvarlak spermatidin canlı olup olmadığına ya da genomik yapısının normal olup olmadığına, hücreyi boyamadan veya parçalamadan karar vermek imkansızdır. Tek kriter mikropipet içine aspire edildikten sonra spermatidin lizis olmadan canlılığını sürdürdüğünün gözlenmesidir. Komplet spermatogenez bozukluğu gösteren testislerin sadece %10’unda yuvarlak spermatid bulunabilmektedir. Daha önceki tahlillerinde azda olsa spermatozoa görülmüş olan olgulardan elde edilen spermatidler kullanılarak yapılan ICSI işleminden elde edilen başarı, şiddetli spermatogenez defekti bulunan olgulardakine göre çok daha düşüktür. Yuvarlak spermatid kullanılacak olgularda işlemin etkinliğinin ve Y kromozom delesyonlarının genetik geçiş risklerinin mutlaka önceden çiftlere izah edilmesi gerekmektedir.
TESE işlemi sırasında spermatid bulunduktan sonra başka hücre aranmasına son vererek bu spermatidin kullanılması ya da araştırmaya spermatozoa bulununcaya kadar devam edilmesi konusu halen tartışılmaktadır. Spermatid bulunan olgularda mutlaka spermatozoada bulunabileceğini savunan araştırmacıların yanı sıra, spermiyogenez arresti olgularında Sertoli hücreleri ile bağlantılarının kesilmesi neticesi daha ileri maturasyon gösteremeyen spermatidlerin spermatozoa olmasa da elde edilebileceğini savunan bilim adamları da bulunmaktadır (44, 45). Çalışmalar, testis dokusunun fazla travmatize edilmesinin ileride atrofi yapabileceğini ve başka uygulamalarda kullanılamaz hale getirebileceğini ortaya koymuştur (46). Bu nedenle hastanın durumu, önceki biyopsileri ve kadın faktörü de göz önüne alınarak bu işlemin sınırına karar verilmesi daha uygun olacaktır.
TESE işlemi sırasında mutlaka skrotal eksplorasyon da yapılmalıdır. Bu sırada vazal ya da epididimal bir obstrüksiyonun varlığı teşhis edilebilirse, mikrocerrahi olarak obstrüksiyon giderilmeli ve uygun anastomoz teknikleri kullanılarak sperm kanallarının bütünlüğü sağlanılmalıdır. Eğer epididimal mikroaspirasyonla sperm elde edilebilecekse, öncelikle bu yapılmalı, yeterli kalite ve kantitede sperm elde edilemiyorsa testislerden doku çıkarılmalıdır. Daha distal obstrüksiyonlarda vaz deferensten aspire edilen sperm de kullanılabilir. Daha önce yapılmamış ise bu olgularda aynı seansta testis biyopsisi de alınmalıdır.
İnfertilite olgularında tanısal amaçlı testis biyopsisi artık uygulanmamaktadır. Proksimal seviyede bir obstrüksiyon ya da nonobstrüktif nedenli azoospermi bulunan erkeklerde skrotal eksplıorasyon yapılmalı, aynı zamanda hem epididimlerin durumu ve vazın açıklığı kontrol edilmeli, hem de MESA veya TESE ile spermatozoa araştırılmalı, bulunursa ileride ICSI’de kullanılmak üzere dondurularak saklanılmalıdır. Gerekirse rekonstrüktif mikrocerrahiye geçilmelidir. Bu sırada testis biyopsisi de alınmalı ve infertilite ile eş zamanlı bulunabilecek başka patolojilerin varlığı, azoosperminin derecesi ve infertilite nedeni olabilecek patolojiler araştırılmalıdır. Buradan da anlaşılacağı üzere, TESE veya testis biyopsisi sadece doku çıkarmak değil, beraberinde ek girişimleri de gerektirebilecek önemli bir uygulamadır. Bunun eğitimini almış uzmanlar, androloglar, tarafından yapılması uygun olur. Diğer yandan, sonuçta ortaya çıkabilecek komplikasyon veya yan etkilerin de tedavisi sorumluluk gerektirir.
TESE işlemi operasyon mikroskopu altında yapılmalıdır (Mikrocerrahi-TESE). Testisin damarlanmasının en az olduğu bölgesi alt kutup iç, dış ve ön yüzü ile üst kutup iç ve dış bölgeleridir. Mikroskop ile damarlanmanın olmadığı alanlardan ince (tercihan göz ameliyatlarında kullanılan) bir bistüri ile kesi yapılması uygun olur. Testis dokusu arasında da yine damarsız hatlardan diseksiyon yapılarak ilerlenilmelidir. TESE işleminde seminifer tubülülerin mikrodiseksiyonla eksize edilmeleri en ideal olan yaklaşımdır. Fibrotik ve kollabe, ince tubülü alanlarının yanında, dolgun ve daha parlak olan tubüllerin seçilerek eksize edilmesi, hem daha az volümde doku çıkarılmasına hem de germinal hücre bulma şansının daha fazla olmasına olanak verecektir. Mümkün olduğu kadar kanatmaksızın kesilen testis tubuli dokuları uygun kültür ortamı içine alınarak bekletilir. Testisin üst ve alt kutuplarından bilateral olarak biyopsilerin alınmasının yeterli olacağı çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. Ya da, her seferinde spermatozoa aranarak bulununcaya kadar işleme devam edilebilir. İşlem sonunda tunika ince absorbe olur bir sütür ile kapatılır. Hemostaz bipolar koter ile sağlanmalıdır.
Biyopsi esnasında testisin, epididimin ve vaz deferensin muyene edilmesi çok önemlidir. Bu sırada gerekirse mikrocerrahi işlemine ihtiyaç duyulabilir. İşlemin uzun sürmesi olasılığını da düşünerek genel anestezi kullanılması uygun olur.
Testislerden sperm elde etmede perkütan iğne aspirasyonu veya biyopsisi de önerilen diğer bir metoddur (47). Özellikle obstrüktif olduğuna daha önce karar verilmiş olgularda tercih edilmelidir. Sperm eldesi konusunda değişik çalışmalarda farklı sonuçlar bildirilmektedir. Ancak, eksplorasyon ile beraber testislerden açık cerrahi teknik ile TESE yapılması daha faydalı ve başarılı bir yöntemdir. Perkütan girişimlerin ancak testis biyopsisi alınmasında uygulanması doğru olur.
Sonuç olarak, azoospermi olgularında TESE ile elde edilen hücrelerin ICSI’de kullanılması, infertilite tedavisinde son derece önemli bir gelişme olmuştur. Daha erken evre germinal hücrelerin kullanılması ile fertilizasyon ve gebelik elde edilmesi gelecekte bu grup hastaların da tedavilerini mümkün kılacaktır. Ancak, yukarıda sayılan nedenlerden dolayı gerek başarının arttırılması gerekse bir komplikasyonla karşılaşmamak için, uygulamaların sadece konunun uzmanı yetkili hekimler tarafından gerçekleştirilmesi son derece önemlidir.
g) TESE ile Alınan Materyalin Hazırlanması ve ICSI’de Uygun Hücrenin Seçimi: Spermi yakından tanıyan androloji uzmanının bir diğer görevi ise TESE için çıkarılan testis dokusu içerisinde en uygun hücrenin elde edilmesinin teminidir. Testis dokusu yukarıda tanımlanan işlemlerle alındıktan sonra önce mekanik yolla parçalanır. Bu işlemin enzimatik digesyon metodu ile yapılması da tavsiye edilmektedir (48). Bizim gözlemlerimiz, mekanik ayrıştırma ile yeterli hücre elde edilemeyen olgularda enzimatik ayrıştırmanın kullanılması yönündedir. Böylece enzimlere (DNAse ve collagenase tip IV) ait muhtemel toksik etkilerden, her ne kadar spermlerin canlılığında bir bozulma yapmadıkları gösterilmişse de, korunulmuş olunur. Bu yöntemlerle eğer spermatozoa görülmüşse bunların ICSI işlemi için hazırlanmaları gerekir. Swim-up uygulanacaksa, testis dokusu ekstresi vortekslendikten sonra 5-10 dk süreyle çökmeye bırakılır. Takiben üstteki sıvı kısmı alınarak bilinen yıkama işlemine, arkasındanda swim- up’a geçilir. Sperm sayısının çok düşük olduğu olgularda direk pellet kullanılabilir. TESE olgularında değişik solüsyonlarla hazırlanmış gradient sistemleri de kullanılabilir. Bu şekilde doku artıkları, eritrositler ve lökositler büyük oranda ortamdan uzaklaştırılmış olunur. Gradient sistemleri kullanılacaksa, bunların miktarları ve santrifüj süreleri sperm sayısına bağlı olarak ayarlanmalıdır (49). Bu teknikte önce lökositler ortamdan uzaklaştırıldığı için, santrifüj sırasında bunlardan ortama çıkabilecek serbest oksijen radikallerinin önceden uzaklaştırılması da mümkün olmaktadır.
TESE işlemi sırasında eritrositlerin ortamdan uzaklaştırılacağı eritrosit eritici mediumları (ELB) kullanılabilir (50). Özellikle biyopsilerin aşırı kanamalı ortamda alındığı olgularda eritrosit eritici solüsyonları faydalı olabilir.
Testis dokusundan sperm elde edildikten sonra bunlar hemen ICSI işleminde kullanılabilecekleri gibi 24-72 saat süreyle kültür ortamında inkübe edilerek bekletilebilirlerde. Bu şekilde, immotil spermatozoaların maturasyonlarını tamamlayarak motil hale geçmeleri ya da yuvarlak spermatidlerin uzayan-uzamış- matür spermatid evrelerine gelmeleri mümkündür (48). Bekleme işlemi inkübatör içinde 37C’de yapılabileceği gibi 30C’de yada oda ısısında da olabilir. Oda ısısında sperm enerji tüketiminin minimal olacağı, bu nedenle daha uzun süreli saklamaların sağlanabileceği ileri sürülmektedir (51). 10 günlük saklamalarda bile motilitenin %20 oranında korunabileceği bildirilmektedir (52).Bu konuda daha geniş serilerin sonuçlarının yol göstereceği kanısındayız.
Testis dokusu alındıktan sonra bir kısmı dondurularak ileri uygulamalar için saklanabilir (53). Ayrıca, TESE yapıldıktan sonra elde edilen spermatozoalar da dondurularak saklanılabilir (39). Testis dokusu veya sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonunun her TESE olgusunda uygulanmasının gerekli olduğu kanısındayız. Bu şekilde, daha sonra yapılacak ICSI olguları için hazır hücre saklanmış olunur. İlk TESE işleminden sonra testiste damarlanmanın bozularak ya da hematom gelişimine bağlı olarak atrofi gelişmesi ve ikinci uygulamalarda hücre bulunmasını güçleştirmesi mümkündür. Testisten elde edilen spermatozoaların kriyoprezervasyonunda canlılık oranı ortalama %30 olarak bildirilmektedir. Dondurulmuş-çözünmüş epididimal spermler kullanılarak yapılan ICSI olgularında gebelik oranları bir çalışmada %33.8 olarak bildirilmiştir (39).
Yukarıda açıklanan uygulamalar sonuçta masraflı ve zahmetli bir sürecin başarısında önemli roller oynarlar. Doğru karar verilerek yapılması durumunda başarı da artacaktır. İşte androlojinin bu alanı, gerekli eğitim ve tecrübeyi içermektedir.
h) ÜYT Uygulamaları Sırasında Erkeğe ait Acil Durumlar: Üremeye yardımcı tekniklerin uygulandığı merkezlerde karşılaşılan en önemli sorunlardan bir diğeri ise inseminasyon ya da oosit toplanması sırasında erkeğin ejakulat verememesi ya da ejakulatta yeterli kalite ve kantitede sperm bulunamamasıdır. O zamana kadar kadına hormonal stimülasyon yapılmış hatta oositleri toplanmış olabilir. Daha önce ejakulat spermi kullanılarak yapılmasına karar verilmiş ve hazırlıkların buna göre yapılmış olduğu olgularda, bunun mümkün olmaması istenmeyen bir durumdur. Ancak, gerekli girişimlerle uygulamanın başarılı bir şekilde tamamlanması mümkündür. Aşağıda bu konuda karşılaşılan güçlükler ve tedavileri açıklanmıştır.
1. Ereksiyon olmaması: Penil ereksiyon, sinir sistemiyle (santral, sistemik, periferik) lokal faktörlerin (sinüzoidal düz kaslar ve endotel) arasındaki etkileşimler sonucunda gelişen hemodinamik bir olaydır (54). Normal bir ereksiyonun olabilmesi iki fonksiyonun birlikte çalışması ile mümkündür: 1) Kavernozal arter ve trabeküler düz kasların tam gevşemesiyle sinüzoidal boşluklara kan girişinin artması ve 2) Genişleyen sinüzoidal boşlukların tunika albuginea altındaki subtunikal venülleri sıkıştırması ve fibroelastik tunikayı gererek arasından geçen emisser venleri komprese etmesi. Bu mekanizmanın işleyebilmesi spinal ve supraspinal nörojenik iletimin sağlamlığına bağlıdır. Supraspinal mekanizmalar ise medulla, pons, diensefalon, korteks ve talamusu ilgilendirmektedir. Supraspinal merkezler üzerine kişinin psikojenik durumunun etkisi ereksiyonun gelişmesinde en önemli faktörlerden birisidir.
Normal bir cinsel işlev için ereksiyonu sağlayan organik komponentler sağlam olmalı, görme, işitme, koku, dokunma yahut imajinasyon şeklinde yeterli ve uygun bir cinsel uyarı olmalı ve pozitif bir cinsel bilgilendirimi bulunmalıdır. Bazı inhibitör faktörler organik hiçbir sorunu bulunmayan kişilerde psikojenik impotansa yol açabilir. Psikojenik nedenli impotansın iki mekanizması olabilir: 1) spinal ereksiyon merkezinin beyinden kaynaklanan nedenlerle suprasakral inhibisyonunda artma olması ve 2) periferal kotekolaminlerde artış (55). Bu faktörler arasında stres, anksiyete ve depresyon değişik mekanizmalarla yeterli ereksiyon gelişmesini önleyebilirler. Psikojenik empotansın terminal etkisi ise muhtemelen sempatik tonüs artımına yol açan mediatör değişiklikleridir. Bunlar penisteki düz kas tonusunu artırarak, ereksiyon için gerekli yeterli sinüzoidal relaksasyonun gelişmesini önlerler.
ÜYT uygulanacak bir erkekte sperm vermek bazen stresli bir hal alabilir. Burada uzun süren hazırlık aşamaları, hastane koşulları, çevresel faktörler ve erkeğin kendini sperm çıkarmaya zorunlu hissetmesi, sperm verememe korkusu ve bunun stresi yeterli bir ereksiyon gelişmesini önleyebilir. Kendi olgularımız arasında da önemli sayıda erkekte bu şekilde bir sorunla karşılaşmaktayız. Eğer hasta daha önceki muayenelerinde ereksiyon ile ilgili bir problemi olduğunu belirtmişse bunun nedenleri araştırılıp, tedavi edildikten sonra ÜYT denenebilir. Önceden böyle bir yakınması olmamışsa, bir fosfodiesteraz inhibitörü olan sildenafil 50-100 mg tek doz verilerek, 1 saat içinde uygun bir uyarım da sağlanılarak denenir. Ya da, bir düz kas dilatatörü olan papaverin HCl veya PGE1 intrakavernozal olarak düşük dozda yapılabilir ve ereksiyonun gelişmesini takiben yine sperm çıkarması istenilir. Gerekirse, hastaya spermisit etkisi bulunmayan, bu amaçla yapılmış, prezervatifler verilerek koit sırasında spermin bunun içinde toplanması sağlanılır. Eğer ICSI yapılması planlanmışsa ve bu uygulamalarla da sperm elde edilememişse, testislerden küçük bir doku alınarak içinde matür sperm hücresi elde edilmeye çalışılır (TESE). Önceden ejakulatında yeterli spermatozoa görüldüğü için, bunlarda küçük bir parça doku çıkarılması yeterlidir.
2. Ejekulatta veya TESE sırasında doku ekstraksiyonunda sperm bulunamaması: İleri derecede oligozoospermisi bulunan bazı olgularda, ICSI yapılacağı gün ejakulatta hiç spermatozoa bulunamıyabilir veya tamamı immotil olabilir. Ejakulatta sperm hücresi bulunamaması durumunda; 2 ml’lik fraksiyonlara ayrılan ejakulat 2 ml medium ile karıştırılarak 5dk 1400 rpm’de santrifüj edilir ve pellet tekrar incelenir. Bu durumda da spermatozoa görülemiyorsa, oluşan süspansiyon bir petri dish’ine yayılır ya da damlacıklar halinde yerleştirilir, ve üzeri mineral oil ile kaplanarak inversiyon mikroskopu altında araştırmaya geçilir. Bu şekilde, daha önce spermatozoa görülemeyen olgularda hücre bulmak mümkündür. Bulunan spermatozoalar mikroenjeksiyon pipetine çekilerek ICSI yapılmak üzere ICSI dish’ine taşınır.
Tamamı immotil spermatozoa bulunması durumunda ise şu seçenekler uygulanabilir:
1. Sperm inkübasyon mediumunda bir süre inkübe edilerek motilite kazanması beklenilebilir.
2. İmmotil hücreler ile ICSI’ye gidilir, ama ICSI dish’i üzerine steril distile laboratuvar suyu 1:1 volümde medium ile karıştırılarak immotil spermler önce bunun içine alınır. Bu hipoozmolar ortamda kuyrukları şişen hücreler (HOS testi) canlı olarak kabul edilerek, yıkandıktan sonra ICSI’de kullanılabilir (Vanderzwalmen P, kişisel görüşme).
3. Hastaya ikinci kez ejakulasyon yaptırılır. Bu durumda motil sperm bulmak mümkündür (36).
4. TESE yapılabilir. Ejakulatta motil hücre bulunmayan olgularda TESE ile motil hücre bulmak mümkündür. Çalışmalar göstermiştir ki, testisten elde edilen spermatozoalarda vitalite ejakulat sperminden daha iyidir (56).
Tournaye, ejakulasyon sperminin kullanılması planlanmış 5380 ICSI siklusunda bu siklusların %93.7’sinde tek bir ejakulattan elde edilen spermatozoaları kullanarak ICSI yaptığını bildirmiştir (57). %4.8’inde ise ancak birkaç adet motil spermatozoa bulurken, %0.2’sinde hiç motil hücreye rastlanılmamış. Siklusların %4’ünde ikinci kez alınan ejakulattaki spermler ile ICSI’ye geçilebilmiş ama bunlarında %5’inde sadece immotil spermatozoa tespit edilebilmiş. Geri kalan %10’unda ise her iki ejakulatta da azoospermi olması ya da tamamının immotil olması nedenleriyle TESE yapılmış. Toplam siklusların % 1.4’ünde metafaz-II oosit bulunamaması veya yeterli spermatozoa bulunamaması nedeniyle ICSI yapılamamış. Sonuçta, immotil spermatozoa ile yapılan işlemlerde %19.8 oranında fertilizasyon elde edilirken hiç gebelik sağlanılamamış. Oysa TESE yapılan böyle olgularda fertilizasyon oranı %63.6, doğum oranı ise %23 olarak bildirilmiştir.
ICSI sırasında fertilizasyon başarısızlığının nedeni esasen yetersiz oosit aktivasyonudur (58). Bunlar arasında fertilizasyon yetmezlikli siklusların %49′ unda immotil spermler ya da akrozomsuz spermler (globozoospermi) gibi spermle ilgili faktörler söz konusudur (59). İmmotil spermler ile fertilizasyon oranları %10.1’e kadar düşebilmektedir (60). Bu nedenle, immoilizasyon yapan patolojiler yeterli bir androlojik muayene ile tam olarak araştırıldıktan sonra ICSI yapılması başarıyı artıracaktır. Burada sorumlu olabilecek faktörler şunlardır (57):
a) Fonksiyonel kuyruk defekti
Aksonem defekti (İmmotil silia sendromu, vb)
Enzimatik defektler (protein-karboksil metilaz yetmezliği, vb)
Enfeksiyon (E.coli)
Antisperm antikorlar
Aksesuar seks gland enfeksiyonu (kronik prostatit, vb)
Epididim veya ejakulatör kanallarda parsiyel obstrüksiyon
b) Absolut nekrozoospermi
Yukarıda belirtilen ayrımı yapabilmek için gerekli olgularda vitalite boya testleri, genital enfeksiyon araştırması, antisperm antikor tayini, transrektal ultrasonografi ya da elektron mikroskopik incelemelerle spermde aksonemin araştırılması istenmelidir. Globozoospermili olgularda akrozom bulunmaması nedeniyle normal sperm-oosit etkileşimi olmayacağından çözüm ICSI iledir. Ama bunlarda da başarı oldukça düşüktür. Örneğin, 8 globozoospermili erkekte fertilizasyon oranları %20.3 bulunurken sadece iki çiftte gebelik elde edilebilmiştir (61). Globozoospermi olgularında oosit aktivasyonunda bir defekt söz konusu olabileceği düşünülerek, bunlarda recombinant oscillin ile artifisyal oosit stimülasyonu yapılması, yakın gelecekte bir tedavi alternatifi olarak görülmektedir (36).
Sonuç olarak görülmektedir ki, infertilite nedeniyle başvuran ve standart tedavi veya ÜYT uygulanan çiftlerde androloji uzmanının, gerek kendi uygulamalarında gerekse laboratuvar çalışanlarını uyararak, dikkatli olması başarıyı önemli oranda arttıracaktır. Bununla birlikte, öncelikle erkekte fizyolojik yoldan gebeliğin sağlanması için tüm gayret gösterilmeli, bunda başarılı olunamıyor ve ÜYT kullanılacaksa genital sistemde en distaldeki vital spermatozoanın kullanılmasına çalışılmalıdır. Son seçenek olarak testiküler spermin elde edilmesi gerekebilir. Spermatid seçimi yapmak gerekiyorsa matür ve kuyruk gelişimi başlamış hücre araştırılmalı, gerekirse inkübe edilerek beklenilmelidir. Bunların dışında, donör inseminasyonu ya da evlat edinme alternatifleri sunulmalıdır. Ailelere olayın genetik riskleri izah edilmelidir.
İşte, klinik olarak erkeğin muayenesinden başlayarak gebeliği sağlayacak en son nokta olan immatür germ hücrelerinin ÜYT’de kullanılmasına kadar olan evrelerde, yukarıda anlatılan müdahalelerin bu konuda uzman androloglar tarafından yapılması, konunun bütünlüğünün uygulanmış olması bakımından gereklidir. Gelecekte, başta moleküler genetik alanında olmak üzere, fertilizasyonun biyokimyasal ve ultrastrüktürel düzeyde ayrıntıları üzerinde çalışmaların artmasıyla erkekte germ hücrelerinin fonksiyon ve yapısının daha iyi anlaşılması sonuçtaki başarı oranını yükseltecektir. Özellikle in vitro germ hücre kültür ortamındaki gelişmeler ve mayozun bu şekilde başarılabilmesi, klonlama yöntemi ile hücre çoğalmasının sağlanabilmesi, ileriye yönelik ümit verici uğraşlardır.
KAYNAKLAR
1. Mosher WD, Pratt WF: Fecundity and infertility in the United Sates: incidence and trends. Fertil Steril, 56: 192-193, 1991.
2. Yamamoto M, Hibi H, Tsuji Y, Mhyake K: The effect of varicocele ligation on oocyte fertilization and pregnancy after failure of fertilization in in vitro fertilization-embryo transfer. Hinyokika Kiyo, 40; 683-687, 1994.
3. Dubin L, Amelar RD: Varicocelectomy: 986 cases in a twelve-year study. Urology, 10; 446-449, 1977.
4. Schlegel PN: Is assisted reproduction the optimal treatment for varicocele- associated infertility? A cost-effectiveness analysis. Urology, 49; 83-90, 1997.
5. Schlegel PN, Goldstein M: Microsurgical vasoepididymostomy: refinements and results. J Urol, 150: 1165-1170, 1993.
6. Torok L: Treatment of oligozoospermia with tamoxifen (open and controlled studies). Andrologia, 17: 497-500, 1985.
7. O’Donovan P, Vandekerckhove P, Lilford L, et al: Treatment of male infertility: is it effective? Review and meta-analyses of published randomized controlled trials. Hum Reprod, 8: 1209-1214, 1993.
8. Suleiman SA, Ali ME, Zaki ZM, el Malik EM, Nasr MA: Lipid peroxidation and human sperm motility: protective role of vitamin E. J Androl, 17: 530-537, 1996.
9. Jarow JP: Life-threatening conditions associated with male infertility. Urol Clin North Am, 21: 409-415, 1994.
10. World Health Organization: WHO semen manual for the examination of human semen and cervical mucus. Cambridge, Cambridge University Press, 1997.
11. Eggert-Kruse W, Bellmann A, Rohr g, tilgen W, Runnebaum B: Differentiation of round cells in semen by means of monoclonal antibodies and relationship with male infertility. Fertil Steril, 58: 1046-1050, 1992.
12. Wolff : Methods for the detection of male genital tracy inflammation. Andrologia, 30 (Suppl 1): 35-39, 1998.
13. Wolff H: The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril, 63: 114-119, 1995.
14. Wolf H, Poltich JA, Martinez A, et al: Leukocytospermia is associated with poor semen quality. Fertil Steril, 53: 528-534, 1990.
15. Turek PJ, Lipshultz LI: Immunologic infertility. Urol Clin North Am, 21: 447-469, 1994.
16. Hill JA, Haimovici F, Politch JA, et al: Effects of soluble products of activated lymphocytes and macrophages (lymphokines and monokines) on human sperm motion parameters. Fertil Steril, 47: 460-465, 1987.
17. Bar-Chama N, Goluboff E, Fisch H: Infection and pyospermia in male infertility: is it really a problem? Urol Clin North Am, 21: 469-475, 1994.
18. Eggert-Kruse W, Pohl S, Naher H, et al: Microbial colonization and sperm- mucus interaction results in 1000 infertile couples. Hum Reprod, 7: 612-620, 1992.
19. Gnarpe H, Friberg J: Mycoplasma and humanreproductive failure. I. The occurrence of different mycoplasmas in couples with reproductive failure. Am J Obstet Gynecol, 114: 727-731, 1972.
20. Busolo F, Zanchetta R: The effect of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum on hamster egg in vitro penetration by human spermatozoa. Fertil Steril, 43: 110-114, 1985.
21. Toth A, Leser ML, Brooks C, et al: Subsequent pregnancies among 161 couples treated for T-mycoplasma genital tract infection. N Eng J Med, 308: 505-507, 1983.
22. Hollanders JMG, Carver-Ward JA: Male infertility from A to Z. Studies in profertility series. vol. 4, p. 27, The Parthenon Pub. New York, 1996.
23. Marshburn PB: The role of antisperm antibodies in infertility. Fertil Steril, 61: 799-811, 1994.
24. Anderson DJ: Cell-mediated immunity and inflammatory processes in male infertility. Arch Immunol Ther Exp, 38: 79-85, 1990.
25. Dimitrov DG, Sedlak R, Nouza K, et al: A quantitativa objective method for the evaluation of antisperm cell mediated immunity in humans. J Immunol Methods, 154: 147-153, 1992.
26. Aitken J, Fisher H: reactive oxygen species generation and human spermatozoa: the balance of benefit and risk. Bioessays, 16: 259-264, 1994.
27. Asch R, Simerly C, Ord T, et al: The stages at which human fertilization arrests: microtubule and chromosome configurations in inseminated oocytes which failed to complete fertilization and development in humans. Hum Reprod, 10: 1897-1906, 1995.
28. Navara C, First N, Schatten G: Microtubule organization in the cow during fertilization, polyspermy, parthenogenesis and nuclear transfer: the role of the sperm aster. Devel Biol, 162: 29-40, 1994.
29. Bar-Chama N, Lamb DJ: Evaluation of sperm function: what is available in the modern andrology laboratory?. Urol Clin North Am, 21: 433-446, 1994.
30. Horbay GLA, Cowell CA, Casper RF: Multiple follicular recruitment and intrauterine insemination outcomes compared by age and diagnosis. Hum Reprod, 6: 947-952, 1991.
31. Horvath P, Bohrer M, Sheldon R, et al: The relationship of sperm parameters to cycle fecundity in superovulated women undergoing intrauterine insemination. Fertil Steril, 52: 288-294, 1989.
32. Riedel HH, Hübner F, Ensslen SC, et al: Minimal andrological requirements for in-vitro fertilization. Hum Reprod, 4(suppl): 73-77, 1989.
33. Edwards RG, Fishel SB, Cohen J, Fehilly CB, et al: J In Vitro Fert Embryo Transf, 1: 3-23, 1984.
34. Van der Zwalmen P, Bertin-Segal G, Geerts L, et al: Sperm morphology and IVF pregnancy ratecomparison between Percoll gradient cetrifugation and swim-up procedure. Hum Reprod, 6: 581-588, 1991.
35. Schlegel PN: Management of ejaculatory duct obstruction. In: Infertility in the male. Lipshultz LI, Howards SS (eds), 3th ed., p: 385-394, Mosby-Year Book, Inc, Missouri, 1997.
36. Colpi GM, Negri L, Mariani ME, Aydos K, et al: Male distal genital tract ultrasonography in excretory infertility. Prog Reprod Biol Med, 15: 119-129, 1992.
37. Schoysman R, van de Casseye M: Epididymal oligospermia, in. Microsurgery of male infertility, Schoysman R (ed), s. 249-254, Fondazione per gli studi sulla riproduzione umana, Palermo, 1994.
38. Schoysman R: Microsurgery of male infertility. Fondazione per gli studi sulla riproduzione umana, Palermo, 1994.
39. Van Steirteghem AV, Nagy P, Joris H, et al: Results of intracytoplasmic sperm injection with ejaculated, fresh and frozen-thawed epididymal and testicular spermatozoa. Hum Reprod, 13(suppl 1): 134-142, 1998.
40. Devroey P: ICSI with testicular sperm: techniques for retrieval in obstructive and non-obstructive azoospermia. Treatment of infertility: the new frontiers. Filicori M, Flamigni C (eds), Communications media for education, New Jersey, 1998.
41. Antinori S, Versaci C, Dani G, et al: Fertilization with human testicular spermatids: four successful pregnancies. Hum Reprod, 12: 286-291, 1997.
42. Silber SJ, Johnson L: Are spermatid injections of any clinical value ? Hum Reprod, 13: 509-523, 1998.
43. Vanderzwalmen P, Nijs M, Schoysman R, et al: The problems of spermatid microinjection in the human: the need for an accurate morphological approach and selective methods for viable and normal cells. Hum Reprod, 13: 515-519, 1998.
44. Tesarik J, Greco E, Mendoza C: ROSI, instructions for use: 1997 update. Hum Reprod, 13: 519-523, 1998.
45. Gandini L, Lenzi A, Lombardo F, et al: Immature germ cell separation using a discontinuous Percoll gradient technique in human semen. Hum Reprod, 14: 1022-1027, 1999.
46. Schlegel PN, Su LM: Physiological consequences of testicular sperm extraction. Hum Reprod, 12: 1688-1692, 1997.
47. Verheyan G, De Croo I, Tournaye H, et al: Comparison of four mechanical methods to retrieve spermatozoa from testicular tissue. Hum Reprod, 10: 2956-2959, 1995.
48. Crabbe E, Verheyen G, Silber S, et al: Enzymatic digestion of testicular tissue may rescue the intracytoplasmic sperm injection cycle in some patients with non-obstructive azoospermia. Hum Reprod, 13: 2791-2796, 1998.
49. Bertin G, Nijs M, Vandamme B, Vanderzwalmen P: Laboratory methods in medically assisted procreation. Schoysman infertility management foundation, Vilvoorde, Belgium, 1997.
50. Nagy ZP, Verheyen G, Tournaye H, et al: An improved treatment procedure for testicular biopsy specimens offers more efficient sperm recovery: case series. Fertil Steril, 68: 376-379, 1997.
51. Tesarik J, Greco E, Rienzi L, et al: Differentiation of spermatogenetic cells during in-vitro culture of testicular biopsy samples from patients with obstructive azoospermia: effect of recombinant follicle stimulating hormone. Hum Reprod, 13: 2772-2781, 1998.
52. Elder K, Elliot T: The use of testicular and epididymal sperm in IVF: culture of testicular sperm. World wide conferences on reproductive biology. p. 46-49, Ladybrook pub., MAD print and delivery, Morley, West Australia 6062, 1998.
53. Fischer R, Baukloh V, Naether OGJ, et al: Pregnancy after intracytoplasmic sperm injection of spermatozoa extracted from frozen-thawed testicular biopsy. Hum reprod, 11: 2197-2199, 1996.
54. Anafarta K, Yaman Ö: Erkek cinsel işlev bozuklukları: etyopatogenez ve tanı. Temel Üroloji, ed: Anafarta K, Göğüş O, Bedük Y, Arıkan N. s. 1043-1084, Güneş Kitabevi, Ankara, 1998.
55. Steers WD: Neurol control of penile erection. Semin Urol, 8: 66-70, 1990.
56. Verheyen G, De Croo I, Tournaye H, et al: Comparison of four mechanical methods to retrieve spermatozoa from testicular tissue. Hum Reprod, 10: 2956-2959, 1995.
57. Tournaye H, Joris H, Verheyen G, Camus M, Devroey P, Van Steirteghem: Sperm parameters, globozoospermia, necrozoospermia and ICSI outcome. Treatment of infertility: the new frontiers. Filicori M, Flamigni C (eds), Communications media for education, New Jersey, 1998.
58. Flaherty SP, Payne D, Swann NJ, Matthews CD: Aetiology of failed and abnormal fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod, 10: 2623-2629, 1995.
59. Liu J, Nagy ZP, Joris H, et al: Analysis of 76 total-fertilization-failure cycles out of 2732 intracytoplasmic sperm injection cycles. Hum reprod, 10: 2630-2636, 1995.
60. Nagy ZP, Liu J, joris H, et al: The results of intracytoplasmic sperm injection is not related to any of the three basic sperm parameters. Hum reprod, 10: 1123-1129, 1995.
61. Liu J, Van Steirteghem AC, Nagy Z, et al: Successful fertilisation and establishment of pregnancies in patients with round-headed spermatozoa. Hum Reprod, 10: 626-629, 1995.
62. Rolf C, Cooper TG, Yeung CH, Nieschlag E: Antioxidant treatment of patients with asthenozoospermia or moderate oligoasthenozoospermia with high-dose vitamin C and vitamin E: a randomized placebo-controlled, double-blind study. Hum Reprod, 14: 1028-1033, 1999.
63. Khorram O, et al: Reproductive technologies for male infertility. J Clin Endocrinol Metab 86: 2373, 2001.
