Prof. Dr. Kaan Aydos
Sperm fonksiyon bozuklukları fertilizasyonun gerçekleşmemesinde en önemli nedenlerden birisi olarak uzun zamandır üzerinde araştırılan bir konu olmuştur. Oysa erkek faktörü infertilitesinin etyolojisinin ancak az bir kısmı anlaşılabilmiş olup, semeni inceleyip etyolojiyi anlamada doğru tanı koyabilme kapasitemiz de buna paralel olarak kısıtlanmaktadır. Androlojistler için semenin kalitatif değerlendirimi uzun yıllar boyunca tek unsur kabul edilmiştir. Başından beri bu değerlendirimin ana dayanağı sperm sayısı olmuştur. Sperm sayısının belirli bir eşik değerin altına inmesi oligozoospermi olarak tanımlanmış olup, infertiliteden sorumlu tutulmaktadır. Erkek faktörü infertilite ile ilişkili olabilecek bozulmuş semen kalitesinin değerlendiriminde diğer parametreler sperm motilite bozuklukları (astenozoospermi), anormal morfoloji (teratozoospermi) ve aşırı lökosit artımı (lökositospermi)’dır. Günümüzde erkeğin fertilite durumunun değerlendirilmesinde bu testlerin kullanımı ve tanımlanmaları dünya sağlık örgütü (WHO) tarafından standardize edilerek bir rapor halinde yayınlanmıştır (1). Burada testlerin yapılması tarif edilmiş ve normal için eşik değerleri verilmiştir. Global standardizasyonun sağlanmasında bu yayın son derece önemlidir. Diğer yandan, her ne kadar WHO tarafından defalarca yenilenmiş, gözden geçirilmiş ve standardizasyonları geniş çapta kabul görmüş olsa da, erkek infertilitesinin tanısında rutinde kullanılan semen analizi bizi yeteri kadar tatmin edici yarara ulaşamamıştır. Rutin semen analizinde kullanılan parametreler ile infertilite arasında ancak zayıf bir ilişki kurulabilmektedir. Ne infertilitenin nedeni ne de hastanın tedavisi konularında yeterli bilgi vermemektedir. Gerçekten de, sperm sayısı <5 milyon/ml gibi patolojik değerlere kadar baskılansa bile böyle erkekler hala fertil olabilmektedirler (2). O halde, sperm konsantrasyonu fertilite göstergesi olarak sınırlı öneme sahiptir. Esas spermin fonksiyonel kapasitesi fertilizasyon için anlam taşır.
Seminal plazmanın görsel değerlendiriminin yetersiz kalması üzerine, 1970 ve 1980’li yıllarda sperm fonksiyonlarını değerlendiren testlerin geliştirilmesi çalışmaları başlamıştır. Ama oositin fertilizasyonu, spermin birbiriyle çok da ilişkisi bulunmayan birçok özelliğini ilgilendiren kompleks bir olay olması nedeniyle, tek başına bir test ile tüm sperm fonksiyonlarını değerlendirmek akılcı olamaz. Bu nedenle, sperm fonksiyonlarının değişik yönlerini ortaya koyan farklı testlerin bir arada kullanımı gerekmektedir. Böylece sperm motilitesinin kompüterize sistemle araştırıldığı (CASA) yöntemler ile servikal mukus penetrasyonu, sperm-zona etkileşimi ve akrozom reaksiyonu değerlendirimi analizleri geliştirilerek kullanılmaya başlanılmıştır. Bunların hepsinin de prognostik önemi mevcut olup, tek başına rutin semen analizinden elde edilemeyecek tanısal bilgiler verebilmektedir (3). Her ne kadar bu testlerin teorik olarak önemleri büyükse de, klinikte kullanımları iki nedenden dolayı kısıtlıdır. Birincisi, fazla iş gücü gerektirmeleri, pahalı olmaları ve teknik güçlükleri; ikincisi ise ICSI’nin yaygın olarak kullanılmaya başlanılmasıyla birlikte bu testlerin fazla önemsenmemesidir. Çünkü ICSI’nin başarısının çoğunlukla gametlerin fonksiyonel sağlamlılığıyla ilişki göstermediği düşünülmektedir (4). Ancak, adı geçen testlerin analizleri aslında ICSI başarısının spermin fonksiyonel durumu ile son derece ilişkili olduğu yönünde bilgiler vermiştir.
Hatta günümüzde, erkek infertilitesinin tanısında spermin görsel ve fonksiyonel yönleriyle değerlendirildiği testlerden sonra artık erkekte fertiliteyi araştıran daha ucuz, daha basit ve kolaylıkla standardize edilebilecek biyokimyasal kriterlerin geliştirildiği yeni bir dönem de başlamıştır. Spermatozoanın fonksiyonel yeterliliğinin değerlendirilmesinde biyokimyasal testler daha yardımcı görülmektedir. Bunlar biyolojik testlere göre daha kolay yapılabilir ve standardize edilebilirler. Aynı zamanda infertilitenin etyolojisi konusunda da yeterli bilgi verebilir. Son yıllarda bu amaçla 2 önemli konu üzerinde çalışılmaktadır: Oksidatif stres ve Y-kromozom delesyonlarını da içeren DNA hasarları. Spermin fonksiyonel ve biyokimyasal analizini yapan testler anormal sperm fonksiyonlarının nedenleri hakkında fikir verebilmelerinin yanı sıra, etkin tedavi yönteminin seçilmesinde de yönlendirici olabilmektedir.
İnfertilite araştırmasında sperm fonksiyonlarının değerlendirilmesi gereken kademeler şunlardır:
1. Sperm-servikal mukus etkileşimi
2. Sperm-zona etkileşimi
3. Sperm-oosit füzyonu
4. Oksidatif stres
5. Sperm DNA hasarları
Sperm-servikal mukus etkileşimi
Doğal yolla fertilizasyonun gerçekleşebilmesi için vajene atılan spermatozoanın sağlıklı biçimde servikal kanaldan geçmesi gerekir. Servikal kanalın içi mukus sekresyonu ile doludur. Özellikle midsiklus sırasında mukusun akıcılığı da artarak spermin geçişine olanak tanır. Servikal mukusun sperm tarafından penetrasyonu normal gebeliğin sağlanmasında o derece önemlidir ki, gestagenler kullanılarak bu mekanizmanın bloke edilmesi esasına dayanan kontraseptif yöntemler bile geliştirilmiştir (5). Servikal bariyerin fertilizasyondaki önemi göz önüne alındığında, infertil erkeklerde spermin fertilizasyon bölgesine taşınmasında bir bozukluğun varlığının gösterilmesi oldukça önem kazanmaktadır. Bu amaçla WHO in vitro ve in vivo sperm-servikal mukus etkileşimini değerlendiren metodları standardize etmiştir (1).
Sperm-servikal mukus etkileşiminin in vivo olarak değerlendirilmesi postkoital test (PKT) ile yapılır. Testin prensibi; kadın midsiklus evresindeyken koitten 9-24 saat sonra servikal mukustan alınan bir damla sıvının mikroskop altında incelenmesiyle spermatozoaların sayı ve motilitelerinin ölçülmesi esasına dayanır. Endoservikste ileri-hızlı tek bir motil spermatozoa gösterilmesi, çiftin infertilite sorununda servikal faktörün sorumlu olmadığına işaret eder. Her ne kadar PKT’in standardizasyonu ve yorumlanmasında güçlükler bulunmaktaysa da, bazı tecrübeli merkezler tarafından prognostik öneminin bulunduğu savunulmaktadır. Örneğin yakın tarihli retrospektif bir çalışmada, 3 yılın altında infertilite yakınması bulunan çiftlerde eğer test pozitif bulunmuşsa iki yıl içerisinde gebe kalma şanslarının %68 olduğu, oysa negatif sonuç gelenlerde bu oranın %17’de kaldığı gösterilmiştir (6). Ama infertilite süresi 3 yılı geçerse, test pozitif bile gelse gebelik oranları düşmektedir. Bu sonuçlar da infertilitenin multifaktöriyel olduğunu ve PKT’in sınırlı değeri bulunduğunu ortaya koymaktadır. Genel kanı normal sonuç alındığında PKT’in tedaviyi yönlendirmede katkıda bulunacağı yöndedir. Yine de PKT, yapılması kolay ve masrafsız olup IUI’un mantıklı bir tedavi çözümü olacağına işaret etmesi bakımından önem taşımaktadır (7).
Sperm-servikal mukus etkileşiminin daha kontrollü değerlendirimi ancak in vitro şartlar kullanılırsa başarılabilir (1). In vitro testlerin, PKT en az 1 kez patolojik bulunmuşsa yapılması önerilir. Donör spermi ve donör servikal mukusu kullanılarak yapılan testlerden alınacak sonuçlar daha fazla yönlendirici olur. Farklı skorlama prensiplerini kullanan çok sayıda değişik servikal mukus penetrasyon testi tanımlanmıştır (8,9). Eğer değerlendirme kriterlerinin detaylarına bakılmazsa, servikal mukus penetrasyonu ağırlıklı olarak spermatozoanın hareket karakterlerine bağlıdır. Servikal mukusun penetrasyonunda özellikle önemi bulunan sperm hareket karakterleri; ortalama hız (path velocity) ve hareket traktının düzgünlüğü (linearity and mean linear index)’dır. Bir diğer parametre ise sperm başının lateral hareketidir. Gerçekten de bazı infertilite olgularında erkekteki tek defekt sperm başının lateral hareketinde amplitüd azalmasıdır. Böyle hastalarda spermatozoa servikal mukusun penetrasyonunu başaramaz. Çünkü sperm başının lateral hareket amplitüdü kuyruk hareketinin amplitüdü ile ilişkili olup, bu da spermatozoa servikal mukus ile karşılaştığında itici güç yaratmaktadır.
Servikal mukus penetrasyon testinin yapılışının klinik güçlüğü, kadında uygun zamanlamanın sağlanmasında tutarsızlıktır. İn vitro test için kadından servikal mukus alınır ve erkeğin spermi ile muamele edilir. Eğer anlamlı bir sonuç almak isteniyorsa servikal mukus kadın tam siklusun ortasındayken toplanmalıdır. Servikal mukus i) doğal sikluslarda veya ii) gonadotropin tedavisi ile ovulasyon indüksiyonu yapılan sikluslarda ya hastanın eşinden ya da donör amaçlı toplanıyorsa inseminasyondan hemen önce toplanır. En iyisi suni olarak hazırlanmış servikal mukus kullanılmasıdır. Suni mukusun da spermatozoa ile karşılaştırıldığı zaman aynı doğal koşullarda olduğu gibi penetrasyon sırasında sperm hareketlerine yeterli direnci göstermesi gerekir. Hyalüronik asit polimerleri bu amaca en uygun materyal olarak önerilmektedir. Spermatozoanın hyalüronik asidi penetrasyonu gerek insan gerekse sığır servikal mukususunu penetre etmesi ile yakın benzerlik gösterir ve sayı, morfoloji ve hareket gibi semen parametrelerine aynı derecede bağımlıdır (10,11). Hem servikal mukusun hem de hyalüronik asidin sperm tarafından penetrasyonu, analiz edilen sperm hareket parametrelerinden ileri-hızlı hareket ve başın lateral hareket amplitüdü karakterleri ile aynı şekilde anlamlı bir bağımlılık ortaya koymaktadır.
Gerek servikal mukus gerekse hyalüronik asit polimerleri kullanılarak yapılan in vitro sperm-servikal mukus penerasyon testleri, semen kalitesine bağlı olarak önemli derecede benzer sonuçlar vermektedirler (correlation coefficient 0.7-0.8)(10). Gerçekten de hyalüronik asit polimerleri, aynı servikal mukusta olduğu gibi spermin geçişini yönlendirecek kanallar oluşturabilmektedir (12). Spermatozoanın hyalüronik asit polimerlerini penetrasyonu, spermatozoanın hareket kabiliyeti ile o kadar yakından ilişkilidir ki, bu teknik sayesinde spermin motilite özellikleri hakkında da oldukça doğru derecede bilgi edinilebilir.
Servikal mukus penetrasyon testinin özellikle immünglobülin A (IgA) sınıfı antisperm antikorlara (ASA) bağlı immünolojik infertilite olgularında da yararlı sonuçlar verdiği görülmektedir. IgA molekülünün Fc kısmı servikal mukus iplikçiklerine sıkıca tutunur. Spermatozoa bu tutunmadan serbest kalmak için çırpındıkça, karakteristik shaking (çırpınma) fenomeni görüntüsü ortaya çıkar. İşte bu çırpınmanın görülmesi durumunda ya spermatozoanın üzerinde ya da servikal mukusun kendisinde IgA antikorlarının bulunduğu anlaşılır. Gerek servikal mukus gerekse hyalüronik asit polimerlerinin kullanıldığı in vitro testler ile ASA’ların varlığı anlaşılabilmektedir (12). Her ne kadar in vitro sperm-servikal mukus etkileşim testleri kolay ve ekonomik olsa da, spermin fertilizasyon potansiyelini saptamada etkinlikleri konusunda daha fazla çalışmalara ihtiyaç bulunmaktadır.
Teknik
İn vitro sperm-servikal mukus penetrasyon testi üç şekilde yapılır: 1) Sperm-servikal mukus kontakt testi likefiye olan spermden bir damla ile bir damla servikal mukusun bir lam üzerinde karıştırılmasıyla yapılır. Spermatozoaların mukus içerisinde normalde olduğu gibi ilerlemesi gerekir. Başlangıçta ve 30 dakika sonra spermin >%25’inin “titreme” şeklinde hareket göstermesi pozitif kabul edilir. 2) Basit lam testi için bir damla servikal mukus örneği lam üzerine konularak üzeri lamel ile örtülür. Tercihan lam lamel arasına içerisinde 100µm boncuklar bulunan silikon yağ konulması, yeterli derinliğin sağlanması açısından önerilmektedir. Lamelin her iki tarafına da semen damlaları bırakılır. Semen lamelin altından kapiller etki ile servikal mukus içerisine doğru yayılır. Bu şekilde hazırlanan preparat 37oC ısıda 30 dk inkübe edilir. Daha sonra mikroskop altında incelenir.
Sperm ile servikal mukusun temas yüzeyinde birkaç dakika içerisinde parmak şeklinde çıkıntılar oluşarak mukus içerisine penetrasyon başlar. Servikal mukus içerisine giren spermatozoalar gelişi güzel yönde dağılarak ilerlerler. Sonucun yorumlanması tamamen subjektiftir, çünkü temas yüzeyinin genişliğini standardize etmek mümkün değildir. 4 kategoride değerlendirme yapılır:
i. Spermatozoaların %90’dan fazlası mukus içinde hareketli olup belirgin ilerleme gösterirler (Normal sonuç).
ii. Spermatozoalar mukus içerisinde temas yüzeyinden itibaren en fazla 500 µm (yaklaşık 10 sperm uzunluğu) ilerleyebilirler (Kötü sonuç).
iii. Spermatozoalar mukus içerisinde hızla hareketlerini kaybederler ya da titreme tarzında hareket etmeye başlarlar (ASA’a bağlı kötü sonuç).
iv. Spermatozoalar mukus içerisine penetre olamazlar ve hemen temas yüzeyinin semen tarafında birikirler (Anormal sonuç).
3) Kapiller tüp testinde spermatozoaların kapiller bir tüpteki servikal mukus kolonuna penetre olma yeteneği ölçülür. Kremer’in tarif ettiği şekliyle 5 cm uzunluğunda, 3 mm genişliğinde ve 0.3 mm derinliğinde düz tüpler kullanılır. Önce bu tüplerin içerisine servikal mukus aspire edilir. Bir ucu plastik tıkaçla kapatılır. Açık ucu, içerisinde semen örneği bulunan bir rezervuara horizontal olarak daldırılır. Nemli ortamda petri kutusu içerisine alınan düzenek 37oC’da bekletilir. 2 ve 24 saat sonra en önde giden spermatozoanın aldığı yol, tüpün ağzından 1 ve 4.5 cm uzaklıktaki sperm yoğunlukları mikroskop altında değerlendirilir (1).
Akrozom reaksiyonu
Akrozom reaksiyonu spermatozoanın zona ile temasının hemen arkasından ortaya çıkan ekzositotik bir olaydır. Bu olayın, daha spermatozoa oosit çevresini penetre edip fertilizasyon başlamadan gerçekleşmesi gerekir. Akrozom reaksiyonunu başlatan esas uyarı, kalsiyumun hücre içine girmesidir. İşte spermin akrozom reaksiyonuna girebilme durumunu değerlendirecek testlerin temelinde de kalsiyumun hücre içerisine akışını sağlayacak iyonofor A23187 ya da progesteron gibi ajanlarla kalsiyum girişinin uyarılması bulunmaktadır. Ancak, fizyolojik koşullarda akrozom reaksiyonunu başlatan diğer faktörler tam olarak aydınlatılamadığı için, testin in vivo geçerliliği tartışmalıdır.
Önceleri triple stain veya trypan blue gibi boyalarla akrozom incelenmekteyken, günümüzde artık floresan mikroskopisi ön plana geçmiştir (13). Aynı zamanda flow sitometri yapılarak da daha fazla sayıda hücre kısa zamanda incelenebilir. Bu amaçla floresanla işaretlenmiş lektinler ve monoklonal antikorlar kullanılmaktadır. Peanut lektinler dış akrozom membranını, pea lektin akrozom içeriğini, CD46 antikoru ise iç akrozom membranını işaretlemek amacıyla kullanılırlar (14). Testin ilk basamağında spermin akrozom reaksiyonu uyarılır. Normalde bu uyarı sperm zona pellusidaya temas ettikten sonra başlar. İn vitro koşullarda bu olay A23187 ya da progesteron ile taklit edilir. Daha sonra supravital boyalar kullanılarak nonspesifik işaretlenmiş olan ölü spermler ayırt edilirler. Arkasından, akrozomun değişik kompartmanları yukarıda tanımlanan ajanlarla işaretlenir, sonuçlar floresan mikroskopu veya flow sitometri ile değerlendirilir.
Gerek lektinler gerekse antikorlar kullanılarak yapılan uyarılmış akrozom reaksiyonu testleri fertilizasyon kapasitesi hakkında uyumlu sonuçlar verirler (15).
Sperm-zona etkileşimi
Sperm-zona etkileşimini ölçmede kullanılacak bir testin geliştirilmesindeki esas sorun bu olayın tamamıyla türe spesifik gelişmesidir. Yani, insan spermatozoasının zona pellusida’ya bağlanması incelenecek ise, mutlaka insan zonası kullanılmalıdır. Zona pellusidayı her zaman taze olarak hazırlamak mümkün olmayabilir. Ancak, insan zona pellusidasının magnezyum klorür ve dekstran içeren tuz solüsyonları içerisinde biyolojik aktivitelerini kaybetmeden saklanabilmeleri bu sorunu kısmen çözmüştür (16).
Testte kullanılacak zona parçaları IVF programında kullanılmayan fazla oositlerden elde edilir. İnsan zonaları arasındaki farklılıkları gidermek içinse hemizona testi tanımlanmıştır. Bu yöntemde zona iki parçaya kesilir. Biri hasta diğeri donör spermi ile inkübe edilir. Zonalara bağlanan spermatozoa sayıları hesaplanır. Böylece hastanın spermatozoasının zonaya bağlanma kapasitesi anlaşılmış olunur (17). Bu yöntemi kullanan geniş seriler hemizona testi ile IVF başarısı arasında anlamlı bir ilişkinin varlığını ortaya koymuştur. Bu testte amaç, spermatozoa üzerinde zona pellusidanın ZP3 reseptörleri ile reaksiyona girebilecek bağlanma bölgelerinin aktif olarak bulunup bulunmadığının anlaşılmasıdır. Ancak, test amacıyla zona pellusida teminindeki güçlükler, biyolojik olarak aktif rekombinan insan ZP3‘ünün geliştirilmesiyle çözülmeye çalışılmaktadır (18). ZP3, zona pellusida üzerinde bulunan glikoproteinler olup, spermatozoa buraya bağlandıktan sonra zonayı geçebilir. Bu teknik sayesinde spermin zona pellusidadaki belirli bağlanma bölgelerini tanıyabilme kapasitesi basit ve standardize bir yöntemle test edilmiş olacaktır. Ama spermin zonayı geçmesinde esas olan bir diğer özelliği de hiperaktif motilitesi sayesinde güçlü bir itici güç oluşturmasıdır. Oysa sadece ZP3 proteinine bağlanmasının test edildiği böyle yöntemlerle bu itici gücün derecesi anlaşılamamaktadır.
Sperm-zona penetrasyonu konusunda daha kullanışlı testlerin geliştirilmesi üzerinde çalışmalar devam etmektedir (19). Örneğin kompetitif bağlanma testi‘nde hasta ve donör spermleri farklı floresan boyalarla (FITC ile yeşil, TRITC ile kırmızı) işaretlendikten sonra zona ile inkübe edilirler. Hasta/donör spermlerinin bağlanma oranlarından hasta sperminin bağlanma kapasitesi hesaplanabilir.
İnsan zona pellusidası, zonaya bağlanmış spermatozoanın akrozom reaksiyonunu geçirip geçirmediği konusunda fikir edinmek amacıyla da kullanılabilmektedir. Böylece, spermi zonaya bağlanan ama akrozom reaksiyonu defekti bulunan infertil bir erkek grubunun varlığı da anlaşılmıştır (20). Her ne kadar bu olgular ICSI ile tedavi edilmekteyseler de, infertilitelerinin etyolojisinin akrozom reaksiyonunda bozukluk olduğunun saptanması ileriye yönelik araştırmaların yönlendirilmesinde hiç kuşkusuz yardımcı olacaktır. Diğer yandan, akrozom reaksiyonunu tamamlamamış spermatozoaların kullanıldığı ICSI olgularında sperm kromatin dekondensasyonunda defekt oluşarak fertilizasyonu bozduğu da bildirilmiştir (21).
Sperm-oosit füzyonu
Sperm fonksiyonlarının değerlendirilmesinde en çarpıcı testlerden biri de zonası çıkarılmış hamster oosit penetrasyon testi‘dir. Hamsterlerden ovulasyon stimülasyonu ile elde edilen çok sayıdaki oosit kumulus hücreleri ve zonadan sırasıyla hyalüronidaz ve tripsin kullanılarak temizlenir. Sadece akrozom reaksiyonunu tamamlamış spermatozoa oolemmaya bağlanabileceği için bu reaksiyonu indüklemek üzere spermler iyonofor A23187 içinde kısa süreli ya da bir gece bekletilirler. Daha sonra zonası çıkarılmış oositlerle bir arada bırakılırlar. Oolemmaya bağlanan ve oosit içerisine giren spermatozoa sayılarına göre sonuçlar değerlendirilir.
Bu test ile akrozom reaksiyonunu tamamlamış spermatozoanın oositin plazma membranına bağlanabilme potansiyeli analiz edilmiş olur. Çünkü normalde bu bağlanmanın arkasından iki membranın (sperm ve oosit plazma membranlarının) füzyonu ve neticede sperm nukleusunun ooplazma içerisine penetrasyonu gerçekleşir. Sperm-oosit etkileşiminin en son basamağı hakkında bilgi verir. Her ne kadar burada kullanılan gametler farklı türlere aitlerse de, füzyon olayının ultrastrüktürel ve moleküler detayları homoloji göstermektedir. Gerçekten de, akrozom reaksiyonunu tamamlamış spermatozoanın ekvatoral segmentinin üzerini örten plazma membranı hamster oositi ile birleşmeyi aynı homolog gametlerde olduğu şekilde başlatabilmektedir (23). Ancak teknik olarak güçlüğü, pahalı olması ve standardizasyonundaki zorluklar bu yöntemin kullanılabilirliliğini kısıtlamaktadır. Standardizasyonundaki güçlük spermin kapasitasyonunu sağlayacak ve akrozom reaksiyonunu başlatacak koşulların sağlanmasındaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Örneğin, spermin kapasitasyonu albumin ya da egg-yolk içeren medyumlar içerisinde 4oC’da bir gece bekletilmesi (22) veya albumin içeren medyumlarda 37oC’da 2-24 saat bekletilmesi (23), hatta NADPH ya da fosfodiesteraz inhibitörleri (pentoksifilin, oksipentifilin) gibi ajanlarla kapasitasyonun suni olarak uyarılması (24) gibi farklı yöntemler kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Böyle farklılıklar şüphesiz sonuçların standardizasyonunda ortak bir kanıya erişilmesini önlemektedir.
Benzer şekilde, akrozom reaksiyonunu uyaracak işlemlerde de farklılıklar vardır. Örneğin progesteron, 4oC’dan 37oC’a ani ısı değişimi, elektrik şoku, divalen katyonik iyonoforlar ve lizofosfatidilkolin bu amaçla kullanılan metodlardır (25,26). Zonası çıkarılmış hamster oosit penetrasyon testini kısmen standardize etmek amacıyla WHO iki değişik preinkübasyon metodu tanımlamıştır (1). Birincisi albumin içeren dengeli tuz solüsyonu içerisinde spermatozoanın 37oC ısıda 18-24 saat bırakılması, ikincisi ise spermatozoanın divalent katyon iyonofor A23187 ile muamele edilmesidir (27). İyonofor A23187 sperm membranında kanallar oluşturarak dışarıdan kalsiyumun hücre içerisine girişini artırır. Artan kalsiyum ise akrozom reaksiyonunu uyarır. Standart semen analizi ile bir kanıya varılamayan idiyopatik infertilitesi bulunan erkeklerde A23187 kullanılarak yapılan sperm-oosit füzyonu testi sonuçları gebelik sonuçları ile anlamlı tutarlılık göstermektedir (3). Aynı tekniğin, IVF sonuçlarını tahmin etmede de etkili olduğu önerilmektedir (28).
Sonuç olarak, akrozom reaksiyonu uyarılarak yapılan sperm-oosit füzyon testleri spermatozoanın hareket yeteneği ile birlikte sperm plazma membranının oosit plazma membranı ile birleşmeye uygunluğu konusunda yeterli bilgi vermektedir.
Oksidatif stres
İnsan spermi oksidatif strese özellikle aşırı duyarlıdır. Çünkü spermatozoa membranı doymamış yağ asitleri bakımından çok zengindir. Doymamış yağ asitleri ise serbest oksijen radikallerine çok hassastırlar (29). Aynı zamanda sperm hücrelerinin kendileri de reaktif oksijen türevleri (ROS) yapabilirler ve sitoplazmalarının çok az olmasından dolayı ROS’un zararalı etkisinden koruyacak olan antioksidan enzimler bakımından da son derece fakirdirler.
Reaktif oksijen türevleri aslında elektronlarını kaybetmiş oksijen metabolitleridir. Bunlar arasında en önemlileri süperoksit anyonu, hidrojen peroksit, hidroksil radikali, hidroperoksil radikali ve nitrik oksit sayılabilir. Fazla miktarda olduklarında hücre yağlarında, proteinlerinde ve DNA’da oksidatif hasara neden olurlar. Çoğu hücreler ya enzimatik antioksidan sistemleriyle (örneğin süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz ve katalaz) ya da nonenzimatik antioksidanlarla (vitamin C ve E) korunurlar. Bu koruyucu mekanizmaların bozulması da oksidatif stresin ortaya çıkmasıyla sonuçlanabilir.
Ejakulatta oksidatif stresin iki kaynağı vardır: seminal lökositler ve anormal spermatozoa (30). Semeni infiltre eden lökositler ROS üretiminde spontan aktiviteye sahip olup, potansiyel olarak oksidatif stres yaratırlar. Eğer semende lökosit konsantrasyonu 3 milyon/ml’yi geçerse fertilizasyonda anlamlı bozulma gözlenir (31). Gerçekten de, bu değerin altındaki olgularda sperm kalitesi bozulmamakta hatta aksi sonuçlar da elde edilebilmektedir (32). O halde, patolojik değerlerdeki lökositospermi durumlarında fertilizasyonla anlamlı bir ilişki aranmalıdır. Lökositosperminin fertilizasyon üzerine olumsuz etkisi ya genital bezlerin fonksiyonlarında neden oldukları bozukluklardan ya da oksidatif stresin gametlerde yaptığı defekten kaynaklanmaktadır. Ancak, seminal plazma spermatozoayı oksidatif stresten koruyacak önemli miktarda antioksidan güce sahiptir (29). Bu nedenle, spermatozoa seminal plazma içerisinde kaldığı müddetçe, lökositosperminin yaratacağı oksidatif stresten bir dereceye kadar korunabilecektir. Ne zaman ejakulat yıkanarak seminal plazma uzaklaştırılır, bu durumda oksidatif stres etkin duruma geçer ve sperm fonksiyonları da bozulmaya başlar (33).
ROS’un ikinci kaynağı spermatozoanın kendisidir. Aslında spermatozoa kapasitasyonu için sinyal iletim mekanizması sırasında faydalanılmak üzere az miktarda süperoksit anyonu ve hidrojen peroksit üretmektedir (34). Ama bazı koşullarda spermatozoanın ROS yapım hızı artar, buda sonuçta oksidatif stres yaratır. Spermatozoanın ROS yapımını artırdığı bazı olası mekanizmalar vardır. Örneğin xenobiotiklerin redoks siklusu, antioksidasyon sisteminde bozukluk, oksidasyon aktivitesinde artış veya hücresel immünite bunlar arasında sayılabilir. Ama spermatozoada oksidatif stresin bilinen en önemli kaynağı matürasyonundaki bozulmadır. Maturasyonu bozulan spermatozoa spermiyogenezin son evresinde fazla sitoplazma artığını atamaz. Bu defektin neticesinde spermatozoa normalden daha fazla ROS yapar ve oksidatif stres belirtileri verir (35). Bunun altında yatan mekanizma tam anlamıyla açıklanmış değildir. Bu mekanizmalardan birisi, fazla sitoplazmik artık taşıyan hücrede aşırı miktarda NADPH yapımıdır (36). Fazla sitoplazma içerisinde aşırı miktarda laktikasit dehidrogenaz, süperoksit dismutaz ve kreatin kinaz gibi sitoplazmik enzimler üretilir. Bu enzimler ise glükoz 6-fosfat dehidrogenaz enzimi üzerinden NADPH ortaya çıkarırlar. NADPH ise NADPH oksidaz tarafından yıkıldığında ortama ROS çıkar. ROS da sperm fonksiyonlarını bozar.
Ejakulatta oksidatif stresi çok sayıda metodla ölçmek mümkündür. Birincisi, hücrede açığa çıkan ROS metabolitlerinin ölçümüdür. Ancak burada problem, lökosit kontaminasyonunun saptanan ROS düzeylerine etkisidir. Çünkü lökositlerin ROS üretim kapasitesi spermden 100 kat daha fazladır. Bu nedenle, spermatozoanın ROS üretim kapasitesini değerlendirmek için ortamda bulunan lökositlerin uzaklaştırılması gerekir. Her ne kadar gradiyent ayrıştırma sistemleri yardımcı olmaktaysalar da, tek başına tüm lökositlerin elimine edilmesinde tam anlamıyla yeterli olamamaktadır (30). En ideali spermi üzeri lökosit antijeni CD45’e karşı oluşturulmuş monoklonal antikorlarla kaplanmış paramanyetik tanecikler veya ferrofluid ile inkübe etmek ve böylece lökositleri uzaklaştırmaktır (37). Arkasından FMLP (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine) provokasyon testi yapılarak lökositlerin elimine edildiği ortaya konulmalıdır (38). Eğer lökositlerin yeteri kadar temizlendiğine karar verilirse spermatozoa forbol ester ile muamele edilerek ROS yapımı uyarılır. Forbol esterin immatür, defektif spermatozoadan ROS üretimini artırıcı etkisi gösterilmiştir (39). Bu etkisi matür, normal spermlerde ortaya çıkmamaktadır.
Serbest radikallerin saptanmasında bir diğer yöntem ise luminol ve lucigenin gibi probları kullanarak yapılan kemiluminesens metodudur (40). Her ne kadar bu probların kullanımında spesifisiteleri ile ilgili bazı problemler bulunmaktaysa da, kemiluminesens yöntemi spermatozoadan kaynaklanan serbest radikal sinyallerini ölçmek için gerekli sensitiviteye sahiptir.
Daha spesifik bir teknik ise asetile ferrisitokrom c redüksiyon metodu olup, tanısal olarak faydalanılabilecek yeterli sensitiviteye sahip değildir.
Oksidatif stresi ölçen biyokimyasal bir başka metod tiobarbitürik asit testi‘dir (TBA). Bu test lipid peroksidasyon ürünleri için spesifik olmamakla birlikte, oksidatif strese bağlı bozulmuş sperm fonksiyonlarının saptanmasında bir kriter olarak kullanılabilir (41). TBA testinde esas reaktan malondialdehit olup, lipid peroksidasyonunun gösterilmesinde sıklıkla kullanılmaktadır (42,43). Çok daha spesifik bir yöntem ise lipid peroksidasyon oluşumunun spektrofotometrik yolla ölçümüdür. Erkek infertilitesinde kullanılan tanısal testler arasında oldukça etkin olduğu önerilmektedir (39).
DNA hasarları
Oksidatif hasara maruz kalan tek hücre komponenti sperm membranı değildir. Bu tür hasarlara spermin nukleusu ve mitokondirisi de oldukça duyarlıdır. Erkek infertilitesinde yüksek oranda sperm nukleusu DNA kırıklarına rastlanılmaktadır (44). DNA hasarları semen kalitesi, özellikle sayısı, ile şiddetli bir korelasyon gösterir. DNA’daki kırıklar spermatozoa tarafından ROS üretiminde artış ile de yakın ilişkilidir. Ayrıca, oksidatif DNA baz hasarları da ortaya konmuştur (45). Böyle oksidasyona bağlı DNA kırılmaları IVF ile tedavi edilmeye çalışılan erkek infertilitesi olgularında fertilizasyon ve gebelik oranlarını olumsuz yönde etkilemektedir (46). Oksidatif stres seviyesindeki artışla paralellik gösteren DNA hasarlanması, sperm fonksiyonlarında daha fazla bozulmaya yol açarak fertilizasyon potansiyelini düşürür (47). Neticede, oksidatif stresin erkekte germ hücrelerinde DNA hasarlanmasını artırıcı potansiyeli, in vitro veya in vivo fertilizasyon sonrasında doğacak çocuğa da bu defektlerin aktarılma potansiyeli bulunduğu kanısını vermektedir.
Sperm DNA hasarlarının önemi özellikle son zamanlarda sigara alışkanlığı olan erkeklerin fertilizasyon potansiyellerini inceleyen çalışmalarla ortaya konmuştur. Aşırı sigara tüketen erkekler oksidatif strese maruz kalmaktadırlar ve C ve E vitamini gibi sistematik antioksidan seviyelerinde de belirgin düşüş gözlenmektedir (48). Gerçekten de, spermatozoa DNA’sında meydana gelen hasarlanmanın bir neticesi olarak, aşırı sigara tüketen erkeklerin doğacak çocukları 4 kat daha fazla çocukluk dönemi kanserlerine yakalanma riski taşırlar (49). Bu bakımdan, DNA hasarı yapan nedenlerin ortaya konması önem taşır, çünkü sigara içmeyen erkeklerde de bu tür hasarlar görülmektedir. DNA hasarlanması sperm kalitesinde bozulmayla doğrudan ilişkili olduğu için, ICSI’de kullanılan gametlerin çoğunun da hasarlı olduğu ortaya çıkmaktadır. Bazı çalışmalarda DNA hasarlarının fertilizasyon ve gebelik oranlarını anlamlı derecede azalttığı gösterilmiştir (50, 51). Diğer yandan, hasarlı DNA’nın ICSI sırasında yeni oluşacak embriyoya da geçebileceği ve neticede doğacak çocukta ortaya çıkması olası yan etkilerin önemi konusunda da ciddi şüpheler öngörülmektedir (50, 52, 53).
Germ hücrelerinde DNA hasarlarının çeşitli teknikler kullanılarak gösterilmesi mümkündür. En duyarlı olanı tek-hücre elektroforez (COMET) metodudur (54). Ancak bu testin kontrolü zor olup, sonuçların yorumlanması karışık bilgisayar proglamlamasını gerektirmektedir. TUNEL (terminal transferase-mediated dUTP nick end labeling) testi ise yapımı daha kolay olup, COMET ile tutarlı sonuçlar vermektedir (55). Bu testlerin bir üstünlüğü, sonuçların flow sitometri ile alınması ve dolayısıyla binlerce hücrenin değerlendirilebilmesine olanak tanımasıdır. Aslında flow sitometri, germ hücrelerinde sperm kromatin strüktür analizi testinde DNA stabilitesinin ölçülmesinde de kullanılmaktadır. Bu testte sperm DNA’sının düşük pH ortamında denatürasyona uğrama hassasiyeti ölçülmekte olup, COMET ile benzer sonuçlar alınabilmektedir (56). Sperm kromatin strüktür analizi testinde elde edilen sonuçlar IVF başarısını tahmin etmede öneme sahiptir (57).
Erkek germ hücrelerinde DNA kırılması sonuçta fertilizasyon potansiyelini azaltıcı ve doğacak çocukta çocukluk dönemi malinite riskini artırıcı öneme sahiptir. Oksidatif DNA hasarlarının bir diğer sonucu ise doğacak çocukta da infertilite riski yaratmasıdır. DNA çift zincirinde bir hasarın belirmesi neticesi ortaya çıkan genetik enformasyondaki eksilmeler homolog rekombinasyon adı verilen bir tamir mekanizması ile onarılmaya çalışılır. Bu mekanizmanın esası kaybolmuş genetik materyalin homolog kromozomlardan alınan ve taşınan hasara karşılık gelen DNA sekanslarının kullanılması şeklinde izah edilmektedir. Ancak tanımlanan mekanizma bütün genom için geçerli olmakla birlikte, sadece Y-kromozomunun uzun kolu üzerinde yerleşmiş genlerde işlemez. Çünkü bu genlerin homologları yoktur. Sonuçta, Y-kromozomunun DNA çift zincirindeki böyle gen delesyonları bu DNA’dan oluşacak yeni nesilde de görülecektir. Spermatogenezden sorumlu çok sayıdaki gen bu bölgede lokalize olduğu için ve de yerine konulamadığından sonuçta spermatogenez yetmezliği ve infertilite ortaya çıkacaktır. Nonobstrüktif azoospermisi bulunan erkeklerin yaklaşık %14’ü Y-kromozomu uzun kolunda gen delesyonları taşırlar (58). Son zamanlarda multipleks polimeraz zincir reaksiyon kitleri kullanılarak böyle hastaların teşhis edilmeleri üzerinde çalışılmaktadır.
Sonuç
Spermin fonksiyonel analizi şüphesiz standart semen analizinin profilini genişletecek ve fertilite potansiyelinin değerlendirilmesinde daha yararlı olacaktır. Ama fonksiyonel testlerin pahalı olması ve sonuçlarındaki standardizasyon eksiklikleri henüz çözümlenmiş değildir. Oysa erkek faktörü infertilite sorunu yaşayan çiftlerin çoğu doğrudan IVF merkezlerine baş vurmakta ve sıklıkla ICSI tedavisine alınmaktadırlar. Eğer spermin fonksiyonel testlerinin faydası ispatlanır ve yaygın olarak kullanılmaya başlanılırsa, fertilizasyon bozukluğunun etyolojisi de açık olarak ortaya konulabilecek, uygun tedavi planları yapılabilecektir. Örneğin sperm-oosit füzyonunda bir bozukluk saptanırsa, bu olgularda sıklıkla oksidatif stresin sorumlu olabileceği düşünülerek tedavi de buna yönelik gerçekleştirilebilir. Oksidatif stres sadece erkek infertilitesinin önemli bir nedeni olmayıp, aynı zamanda doğacak çocukta malinite geliştirme riski ve infertiliteye neden olabilecek Y-kromozom delesyonlarına neden olma gibi yan etkileriyle de önemlidir. Mutlaka oksidatif stres erkek infertilitesinin tek nedeni değildir. Benzer başka faktörler de sperm fonksiyonlarında bozukluk yapabilirler ve neticede sperm-servikal mukus penetrasyon bozukluğu, zona ile uyarılmış akrozom reaksiyonu yetmezliği veya zona penetrasyonunda başarısızlık gibi değişik kademelerde fetilizasyonu bozabilirler. Bu konular üzerinde daha fazla araştırılmaların yapılması gerekmektedir.
Kaynaklar
1. World Health Organization: World Health Organization Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. 4th ed, Cambridge University Press, Cambridge, 1999.
2. Wallace EM, Aitken RJ, Wu FC: Residual sperm function in oligozoospermia induced by testosterone enanthate administered as a potential steroid male contraceptive. Int J Androl. 1992; 15: 416-24.
3. Aitken RJ, Irvine DS, Wu FC: Prospective analysis of sperm-oocyte fusion and reactive oxygen species generation as criteria for the diagnosis of infertility. Am J Obstet Gynecol. 1991; 164: 542-51.
4. Twigg JP, Irvine DS, Aitken RJ: Oxidative damage to DNA in human spermatozoa does not preclude pronucleus formation at intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. 1998; 13: 1864-71.
5. Kovacs GT, Hendricks J, Summerbell D, Baker HW: A pre-coital pill? A preliminary in vitro study. Br J Fam Plann. 2000; 26: 165-6.
6. Glazener CM, Ford WC, Hull MG: The prognostic power of the post-coital test for natural conception depends on duration of infertility. Hum Reprod. 2000; 15: 1953-7.
7. Farhi J, Valentine A, Bahadur G, Shenfield F, Steele SJ, Jacobs HS: In-vitro cervical mucus-sperm penetration tests and outcome of infertility treatments in couples with repeatedly negative post-coital tests. Hum Reprod. 1995; 10: 85-90.
8. Katz DF, Overstreet JW, Hanson FW: A new quantitative test for sperm penetration into cervical mucus. Fertil Steril. 1980; 33: 179-86.
9. Mortimer D, Pandya IJ, Sawers RS: Relationship between human sperm motility characteristics and sperm penetration into human cervical mucus in vitro. J Reprod Fertil. 1986; 78: 93-102.
10. Mortimer D, Mortimer ST, Shu MA, Swart R: A simplified approach to sperm-cervical mucus interaction testing using a hyaluronate migration test. Hum Reprod. 1990; 5: 835-41.
11. Aitken RJ, Bowie H, Buckingham D, Harkiss D, Richardson DW, West KM: Sperm penetration into a hyaluronic acid polymer as a means of monitoring functional competence. J Androl. 1992; 13:44-54.
12. Tang S, Garrett C, Baker HW: Comparison of human cervical mucus and artificial sperm penetration media. Hum Reprod. 1999; 14: 2812-7.
13. Aitken RJ, Brindle JP: Analysis of the ability of three probes targeting the outer acrosomal membrane or acrosomal contents to detect the acrosome reaction in human spermatozoa. Hum Reprod. 1993; 8: 1663-9.
14. Fenichel P, Hsi BL, Farahifar D, Donzeau M, Barrier-Delpech D, Yehy CJ: Evaluation of the human sperm acrosome reaction using a monoclonal antibody, GB24, and fluorescence-activated cell sorter. J Reprod Fertil. 1989; 87: 699-706.
15. Fenichel P, Donzeau M, Farahifar D, Basteris B, Ayraud N, Hsi BL: Dynamics of human sperm acrosome reaction: relation with in vitro fertilization. Fertil Steril. 1991; 55: 994-9.
16. Yanagimachi R, Lopata A, Odom CB, Bronson RA, Mahi CA, Nicolson GL: Retention of biologic characteristics of zona pellucida in highly concentrated salt solution: the use of salt-stored eggs for assessing the fertilizing capacity of spermatozoa. Fertil Steril. 1979; 31: 562-74.
17. Franken DR, Oehninger S, Burkman LJ, Coddington CC, Kruger TF, Rosenwaks Z, Acosta AA, Hodgen GD: The hemizona assay (HZA): a predictor of human sperm fertilizing potential in in vitro fertilization (IVF) treatment. J In Vitro Fert Embryo Transf. 1989; 6: 44-50.
18. van Duin M, Polman JE, De Breet IT, van Ginneken K, Bunschoten H, Grootenhuis A, Brindle J, Aitken RJ: Recombinant human zona pellucida protein ZP3 produced by chinese hamster ovary cells induces the human sperm acrosome reaction and promotes sperm-egg fusion. Biol Reprod. 1994; 51: 607-17.
19. Liu DY, Baker HW: A new test for the assessment of sperm-zona pellucida penetration: relationship with results of other sperm tests and fertilization in vitro. Hum Reprod. 1994; 9: 489-96.
20. Liu DY, Baker HW: A simple method for assessment of the human acrosome reaction of spermatozoa bound to the zona pellucida: lack of relationship with ionophore A23187-induced acrosome reaction. Hum Reprod. 1996; 11: 551-7.
21. Hewitson LC, Simerly CR, Tengowski MW, Sutovsky P, Navara CS, Haavisto AJ, Schatten G: Microtubule and chromatin configurations during rhesus intracytoplasmic sperm injection: successes and failures. Biol Reprod. 1996; 55: 271-80.
22. Johnson AR, Syms AJ, Lipshultz LI, Smith RG: Conditions influencing human sperm capacitation and penetration of zona-free hamster ova. Fertil Steril. 1984; 41: 603-8.
23. Aitken RJ, Elton RA: Application of a Poisson-gamma model to study the influence of gamete concentration on sperm-oocyte fusion in the zona-free hamster egg penetration test. J Reprod Fertil. 1986; 78: 733-9.
24. Aitken RJ, Harkiss D, Knox W, Paterson M, Irvine DS: A novel signal transduction cascade in capacitating human spermatozoa characterised by a redox-regulated, cAMP-mediated induction of tyrosine phosphorylation. J Cell Sci. 1998; 111: 645-56.
25. Aitken RJ: Diagnostic value of the hamster oocyte penetration assay. Int J Androl. 1984; 7: 273-5.
26. Tarin JJ, Trounson AO: Zona-free sperm penetration assay and inducers of the acrosome reaction: a model for sperm microinjection under the zona pellucida. Mol Reprod Dev. 1993; 35: 95-104.
27. Aitken RJ, Ross A, Hargreave T, Richardson D, Best F: Analysis of human sperm function following exposure to the ionophore A23187. Comparison of normospermic and oligozoospermic men. J Androl. 1984; 5: 321-9.
28. Aitken RJ, Clarkson JS: Cellular basis of defective sperm function and its association with the genesis of reactive oxygen species by human spermatozoa. J Reprod Fertil. 1987; 81: 459-69.
29. Jones R, Mann T, Sherins R: Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil Steril. 1979; 31: 531-7.
30. Aitken RJ, West KM: Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leucocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients. Int J Androl. 1990; 13: 433-51.
31. Wolff H, Politch JA, Martinez A, Haimovici F, Hill JA, Anderson DJ: Leukocytospermia is associated with poor semen quality. Fertil Steril. 1990;5 3: 528-36.
32. Kaleli S, Ocer F, Irez T, Budak E, Aksu MF: Does leukocytospermia associate with poor semen parameters and sperm functions in male infertility? The role of different seminal leukocyte concentrations. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2000; 89: 185-91.
33. Aitken RJ, Clarkson JS: Significance of reactive oxygen species and antioxidants in defining the efficacy of sperm preparation techniques. J Androl. 1988; 9: 367-76.
34. de Lamirande E, Gagnon C: A positive role for the superoxide anion in triggering hyperactivation and capacitation of human spermatozoa. Int J Androl. 1993; 16: 21-5.
35. Gomez E, Buckingham DW, Brindle J, Lanzafame F, Irvine DS, Aitken RJ: Development of an image analysis system to monitor the retention of residual cytoplasm by human spermatozoa: correlation with biochemical markers of the cytoplasmic space, oxidative stress, and sperm function. J Androl. 1996; 17: 276-87.
36. Aitken RJ, Fisher HM, Fulton N, Gomez E, Knox W, Lewis B, Irvine S: Reactive oxygen species generation by human spermatozoa is induced by exogenous NADPH and inhibited by the flavoprotein inhibitors diphenylene iodonium and quinacrine. Mol Reprod Dev. 1997; 47: 468-82.
37. Aitken RJ, Buckingham DW, West K, Brindle J: On the use of paramagnetic beads and ferrofluids to assess and eliminate the leukocytic contribution to oxygen radical generation by human sperm suspensions. Am J Reprod Immunol. 1996; 35: 541-51.
38. Krausz C, West K, Buckingham D, Aitken RJ. Krausz C, West K, Buckingham D, Aitken RJ: Development of a technique for monitoring the contamination of human semen samples with leukocytes. Fertil Steril. 1992; 57: 1317-25.
39. Gomez E, Irvine DS, Aitken RJ: Evaluation of a spectrophotometric assay for the measurement of malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals in human spermatozoa: relationships with semen quality and sperm function. Int J Androl. 1998; 21: 81-94.
40. Aitken RJ, Buckingham DW, West KM: Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J Cell Physiol. 1992; 151: 466-77.
41. Aitken RJ, Harkiss D, Buckingham DW: Analysis of lipid peroxidation mechanisms in human spermatozoa. Mol Reprod Dev. 1993; 35: 302-15.
42. Aydos K, Soygur T, Kupeli B, Unsal A, Tolunay O, Erdem E, Guven C, Kupeli S: Testicular effects of vasectomy in rats: an ultrastructural and immunohistochemical study. Urology. 1998; 51: 1051-6.
43. Aydos K, Kupeli B, Soygur T, Unsal A, Erden E, Tulunay O, Kupeli S: Analysis of the relationship between histologic alterations and the generation of reactive oxygen species in vasectomized rat testes. Urology. 1998; 51: 510-5.
44. Irvine DS, Twigg JP, Gordon EL, Fulton N, Milne PA, Aitken RJ: DNA integrity in human spermatozoa: relationships with semen quality. J Androl. 2000; 21: 33-44.
45. Shen HM, Chia SE, Ong CN: Evaluation of oxidative DNA damage in human sperm and its association with male infertility. J Androl. 1999; 20: 718-23.
46. Host E, Lindenberg S, Smidt-Jensen S: The role of DNA strand breaks in human spermatozoa used for IVF and ICSI. Acta Obstet Gynecol Scand. 2000; 79: 559-63.
47. Aitken RJ, Gordon E, Harkiss D, Twigg JP, Milne P, Jennings Z, Irvine DS: Relative impact of oxidative stress on the functional competence and genomic integrity of human spermatozoa. Biol Reprod. 1998; 59: 1037-46.
48. Fraga CG, Motchnik PA, Wyrobek AJ, Rempel DM, Ames BN: Smoking and low antioxidant levels increase oxidative damage to sperm DNA. Mutat Res. 1996; 13: 199-203.
49. Ji BT, Shu XO, Linet MS, Zheng W, Wacholder S, Gao YT, Ying DM, Jin F: Paternal cigarette smoking and the risk of childhood cancer among offspring of nonsmoking mothers. J Natl Cancer Inst. 1997; 89: 238-44.
50. Lopes S, Sun JG, Jurisicova A, Meriano J, Casper RF: Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation is increased in poor-quality semen samples and correlates with failed fertilization in intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril. 1998; 69: 528-32.
51. Benchaib M, Braun V, Lornage J, Hadj S, Salle B, Lejeune H, Guerin JF: Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique. Hum Reprod. 2003; 18: 1023-8.
52. Sun JG, Jurisicova A, Casper RF: Detection of deoxyribonucleic acid fragmentation in human sperm: correlation with fertilization in vitro. Biol Reprod. 1997; 56: 602-7.
53. Ahmadi A, Ng SC: Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J Exp Zool. 1999; 284: 696-704.
54. Irvine DS, Twigg JP, Gordon EL, Fulton N, Milne PA, Aitken RJ: DNA integrity in human spermatozoa: relationships with semen quality. J Androl. 2000; 21: 33-44.
55. Donnelly ET, O’Connell M, McClure N, Lewis SE: Differences in nuclear DNA fragmentation and mitochondrial integrity of semen and prepared human spermatozoa. Hum Reprod. 2000; 15: 1552-61.
56. Aravindan GR, Bjordahl J, Jost LK, Evenson DP: Susceptibility of human sperm to in situ DNA denaturation is strongly correlated with DNA strand breaks identified by single-cell electrophoresis. Exp Cell Res. 1997; 236: 231-7.
57. Larson KL, DeJonge CJ, Barnes AM, Jost LK, Evenson DP: Sperm chromatin structure assay parameters as predictors of failed pregnancy following assisted reproductive techniques. Hum Reprod. 2000; 15: 1717-22.
58. Pryor JL, Kent-First M, Muallem A, Van Bergen AH, Nolten WE, Meisner L, Roberts KP: Microdeletions in the Y chromosome of infertile men. N Engl J Med. 1997; 336: 534-9.
