SPERMATOGONİAL KÖK HÜCRE NAKLİ

Kök hücreler (Stem cell) hayat boyunca kendi kendilerini yenileyerek, farklılaşma kapasitesine sahip yeni hücre serileri (progenitor hücreler) üreten hücrelerdir. Bu hücre serileri de daha ileri farklılaşmaya uğrayarak, dokuya özgü fonksiyonları olan özgül hücreleri meydana getirirler. Özellikle kemik iliği, epidermis, barsak epiteli ve spermatogenez gibi sistemler, kök hücreler sayesinde kendilerini sürekli olarak yenilerler.

Testislerde spermatozoanın oluşumunda kullanılan kök hücre ise “spermatogonium“dur. Spermatogonial kök hücreler vücutta bölünerek ileri jenerasyonlara gen nakledebilen tek hücre grubu olması nedeniyle özellik gösterir. Seminifer tubüller içerisinde yer alan spermatogonial kök hücreler primordial germ hücrelerinden morfolojik olarak farklı bir görünüme sahiptirler ve “prospermatogonium” adını alırlar. Kök hücresinin daha ileri hücrelere farklılaştığının ilk göstergesi, meydana gelen iki yeni hücrenin birbirlerine hücreler-arası sitoplazmik köprü ile bağlanmış olmasıdır (Jeong 2003).

Spermatogonium, fertilizasyonu takiben 7.5 günde, yolk kesesi duvarında lokalize epiblast hücrelerinden farklılaşan primordial germ hücrelerinden meydana gelir (Feng 2002). Bu hücreler dorsal mezanter boyunca ilerleyerek genital kabartı içerisine girerler. Daha sonra etrafları somatik Sertoli hücreleri ile çevrelenerek prospermatogonia ya da gonositleri oluştururlar. Doğumu takiben gonositler seminifer tubüllerin bazal membranı üzerine doğru yer değiştirerek, tip A spermatogonium adını alır ve artık burada lokalize duruma geçerler.

Tip A spermatogonium ya mitozla bölünerek kök hücre havuzunu idame ettirir, ya da spermatozoa’yı oluşturmak üzere farklılaşır. Aslında spermatogonial kök hücrelerin en önemli özelliği yüksek miktarda telomeraz aktivitesi içermeleridir. Bunun anlamı, bu hücrelerin yaşam sürelerinin çok uzun olmasıdır. Germ hücreleri daha ileri farklılaştıkça telomeraz aktiviteleri de azalır (Ravindranath 1997). Spermatozoada hiç telomeraz aktivitesi bulunmadığı gösterilmiştir. Eksperimental olarak telomeraz aktivitesi bloke edildiğinde, testislerde germ hücreleri de tamamen ortadan kalkmaktadır. Aksine, ektopik telomeraz aktivitesi varsa bazı hücrelerin yaşam süreleri uzar, hatta ölümsüz hale geçebilirler (Hahn 1999). Gerçekten de, in vitro şartlarda telomeraz aktivitesinin aşırı arttırıldığı durumlarda spermatogoniumun farklılaşmaksızın idame ettirilebileceği önerilmiştir (Morales 1999).

Yukarıda belirtildiği gibi, tip As spermatogonium (single spermatogonium) spermatogenezde kök hücredir (de Rooij 1998). As spermatogoniumlar bölündüklerinde bir kısmı birbirlerinden ayrılarak yeni kök hücreleri oluştururlar, diğer kısmı ise hücreler arası bir köprü ile birbirlerine bağlı kalarak Apr spermatogoniumları (paired) yaparlar. Apr spermatogoniumlar ileri farklılaşmaya uğramaya programlanmış ilk hücre serisidir. Daha sonra 4, 8, 16 hücreye bölünerek çoğalır. Bunlara Aal spermatogonium (aligned) adı verilir. Aal spermatogoniumlardan da artık farklılaşma belirtileri gösteren hücre serisi, A1 spermatogoniumlar meydana gelir. Bunlar 6 kez bölünerek sonuçta B tip spermatogoniumları yaparlar ki bunlar da mitozu tamamlayarak spermatositlere dönüşürler (Izadyar 2000).

İşte spermatogonial kök hücreler testislerden elde edilip in vitro ortamda saklanabilirlerse, daha sonra tekrar testise nakledildiklerinde bir çok amaçla kullanılabilirler. Spermatogonium transplantasyonu günümüzde eksperimental temelde geniş olarak araştırılmaktadır (Brinster and Avarbock 1994). Bu teknikten beklenilen yararlar 1) spermatogenezin daha iyi anlaşılabilmesi; 2) transgenic hayvanların elde edilmesi; ve 3) erkek infertilitesinin tedavisidir. Aslında erkek infertilitesinde spermatogonium transplantasyonunun esas kullanım amacı, kemoterapi ve radyoterapi öncesi kök hücrelerin saklanarak, daha sonra tekrar testislere nakledilmesi ve böylece üremesinin devam ettirilebilmesi beklentisidir.

Testislerde kök hücre transplantasyonu teknik olarak bazı basamakları gerektirir. Bunlar spermatogonial kök hücrelerin izolasyonu, saklanması, içine farklı genlerin transfeksiyonu, alıcı testisin hazırlanması ve nihayet hücrelerin transplante edilmesi yöntemleridir.

Günümüzde immündefisitli hayvanların rahatlıkla elde edilebilmesi ve transplantasyon tekniklerindeki ilerlemeler sonucu fareler kök hücre nakli konusunda üzerinde en fazla çalışılan canlı olma özelliğindedir. Aşağıda anlatılacak çoğu çalışmada farelerden elde edilen verileri bildirmektedir.

Spermatogonial kök hücrelerin izolasyonu ve saflaştırılması

Germ hücrelerini izole etmek için, testisten alınan küçük doku parçaları önce mekanik işlemlerle parçalara ayrılır ve arkasından enzimlerle muamele edilerek ayrıştırılır. Bu amaçla daha 20 yıl önce tripsin ve Dnase I kullanılmaya başlanılmıştı (Meistrich 1973). Açığa çıkan DNA’nın hidrolizi ile birlikte tripsin’in yapacağı ayrıştırma, tek başına mekanik ayrıştırmayla karşılaştırıldığında hem hücreleri daha az travmatize etmekte hem de ortama çıkardığı canlı hücre sayısı daha fazla olmaktadır. Bu yöntemi takiben iki basamaklı enzimatik dijesyon yöntemi gündeme getirildi (Barcellona and Meistrich 1977). Burada testis dokusu önce kollajenaz ile muamele edilerek bazal membran parçalanmakta, interstisiyel hücreler ayrıştırılmakta ama seminifer tubüller parçalanmadan bütün bırakılmaktadır. Bunu takiben seminifer tubüller tripsin ve Dnase içine alınmakta ve böylece germ hücre popülasyonu pürüfiye halde elde edilmektedir. Bu “kibar” yöntem ile hücreler daha da az travmatize olmakta ve daha önemlisi simplast oluşumu minimalize edilmektedir. Simplast hücrelerin birbirine yapışık kalmasıdır ve enzimatik ayrıştırmanın en sorunlu problemini teşkil eder. Başka çalışmalarda kollajenazın tripsin yerine tercih edilmesinin bir nedeni de budur.

Diğer yandan, rat testislerinde yapılan çalışmalarda tripsin / kollajenaz / hyalüronidaz kombinasyonu ile dijesyon, arkasından ise kollajenaz ve hyalüronidaz içerisinde inkübasyon yapılarak %25-35 oranında tip A spermatogonium süspansiyonu elde edilmesi başarılmıştır (van Pelt 1996). Başka eksperimental çalışmalarda da inkübasyon süresi bir miktar uzatılarak %30 civarında saf spermatogoniumların elde edilmesi sağlanmıştır.

Testis dokusu yukarıda anlatıldığı şekilde parçalandıktan sonra elde edilen hücre süspansiyonu içerisinden spermatogoniumların saf olarak ayrıştırılması da ayrı bir teknik gerektirir. Bu amaçla sedimentasyon velositi (Bellve 1977), Percoll içerisinde dansiteye bağlı santrifüj (Meistrich and Trostle 1975) ve santrifüj ile ayrıştırma (Grabske 1975) yöntemleri kullanılmıştır.

Aslında spermatogoniumların saf olarak elde edilmeleri sadece izolasyon tekniğine bağlı olmayıp, bu hücrelerin testiste, dolayısıyla testiküler hücre süspansiyonu içerisindeki miktarı ile de yakından ilgilidir. Tip As spermatogoniumlar farklılaşmamış spermatogonium popülasyonunun yaklaşık %10’unu, bütün spermatogoniumların %1’ini ve nihayet tüm germ hücrelerinin sadece %0.03’ünü teşkil eder (Tegelenbosch and de Rooij 1993). Bu durumda araştırma yaparken spermatogonial kök hücrelerin saf olarak elde edilebilmesi için öncelikle germ hücrelerinin tamamını içermeyen testislerde çalışmak daha kolay olacaktır. Gerçekten de, genç farelerde yapılan çalışmalarda %90 oranında saf A spermatogonia sağlanabilmiştir. Hatta 80 günlük domuzların testisleri kullanıldığında bu oran %95-98’e çıkmaktadır (Dirami 1999). Burada sedimentasyon velositesi tekniği kullanılmış ve Sertoli hücrelerinin kültür tabağına yapıştırılması yöntemiyle eliminasyonu (differential adhesion tekniği) sağlanmıştır. Ama rutin uygulamalarda genelde saf spermatogonium tip A elde oranı %30 civarındadır. Eğer “differential adhesion” tekniği kullanılırsa bu oran %45, Percoll dansite santrifüj tekniği kullanılırsa %80 olabilmektedir (Izadyar 2000) . En iyi sonuç 5 aylık sığırlarda elde edilmiş olup, yaş ilerledikçe daha gelişmiş germ hücrelerinin de işe karışmasıyla saf hücre elde oranları da düşmektedir.

Aslında genç hayvanlar kullanılsa da elde edilen süspansiyon içerisinde farklılaşmamış tip A spermatogoniumlarının yanı sıra, daha fazla sayıda farklılaşmakta olan tip A1-A4 spermatogoniumlar da bulunmaktadır. Farklılaşmamış spermatogonium oranı ise diğer hücrelerin sadece %1’ini oluşturmaktadır. Pür farklılaşmamış spermatogonium elde etmek içinse bu hücrelerin zenginleştirileceği başka teknikler önerilmektedir. Örneğin, vitamin A defisitli adult farelerde (VAD fareler) spermatogenez farklılaşmamış spermatogonium seviyesinde arrest halde bulunur ve hücreler farklılaşmakta olan spermatogonium seviyesine erişemez (van Pelt 1995). Gerçekten de, VAD hayvan testisleri kullanıldığında %80-90 oranında saf farklılaşmamış tip A spermatogoniumlar hazırlanabilmektedir (Schrans-Stassen 1999). Saf farklılaşmamış spermatogonium sağlanmasında VAD hayvan kullanımının yanı sıra, kriptorşidik ya da radyasyon uygulanmış testislerde de hemen hemen aynı seviyede hücre arresti elde edilebilmektedir.

Spermatogonial kök hücrelerinin dondurulması

Kanser hastalarında fertilizasyon sorununu çözmek için kök hücre transplantasyonu uygulanacaksa, spermatogonial kök hücrelerin dondurularak saklanması gerekir. Bu güne kadar fare ve hamsterleri de içeren bir çok hayvan türünde dondurulmalarını takiben spermatogoniumların spermatogenezi başlatabildikleri gösterilmiştir (Ogawa 1999).

Dondurma işleminde kullanılan yöntem diğer somatik hücreler için kullanılan ile benzerdir. Hücrelerin üzerine çok yavaş olarak besi yeri, DMSO ve serum eklenir, -70oC’da dondurulur ve sıvı nitrojen içerisine daldırılarak saklanır (Avarbock 1996). Çözüldüğünde hücrelerin yaklaşık %60’ı canlı kalmaktadır. Kaybolanlarda çıkarıldığında, yaklaşık olarak hücrelerin %30’unun elde edilebileceği söylenilebilir. Örneğin hamsterlerde germ hücrelerinin çözünmesini takiben orijinal hücrelerin %43’ü canlı olarak elde edilebilmiştir (Ogawa 1999). Ama saf kök hücre sağlanması düşünüldüğünde bu oranın bir miktar düşeceği akılda tutulmalıdır.

Ne olursa olsun, ileride transplantasyonda kullanılmak üzere spermatogonial kök hücrelerin dondurularak saklanması uygulanabilir bir yöntemdir.

Spermatogoniumların hücre kültürü

Spermatogoniumların içinde gelişmelerinin sağlanacağı çok sayıda kültür ortamı tanımlanmıştır. Sertoli hücreleri ile germ hücrelerinin bir arada kültürünün yapıldığı yeni doğan farelerde 3 gün süresince canlılıklarında bir azalma olmadığı ortaya konmuştur. Erişkin farelerde ise içerisine serum eklenmiş ortamda germ hücrelerinin 4 aydan fazla saklanabileceği gösterilmiştir (Nagano 1998). Ancak önemli olan husus, kök hücrelerinin idamesi için bir besleyici (feeder) tabakanın gerekli olduğudur. Çünkü sadece bir feeder tabakası üzerinde bekletilmiş germ hücrelerinin, busulfan ile içi boşaltılmış testise nakledilmeleri durumunda yaşayabildikleri ortaya konmuştur (Nagano 1998). Besleyici, feeder tabakaları, kök hücrelerin yaşayabilmeleri için gerekli olan bazı önemli growth faktörleri salgılamaktadırlar. Bu amaçla Vero hücre kültürü ve STO sıklıkla önerilmektedir. STO; embriyonik fibroblastlardan hazırlanmış bir feeder tabakasıdır (Jeong 2003).

Kültür ortamı için bir diğer önemli faktör de içerisine serum eklenmesidir. Eğer serum eklenirse 2 hafta süresince spermatogoniumların %80’i canlı kalırken, serum konmamış ortamda ancak %20-60 hücre yaşamını devam ettirebilmektedir. Ayrıca, KSOM adı verilen ve potasyumdan zengin bir besi yerinde kültüre edilme durumunda spermatogoniumların %50’si 3 gün süresince canlı kalmakta, serum eklenmediğinde ise bu oran %20’ye düşmektedir (Dirami 1999). Yüzeyi Matrigel ile kaplanmış kültür tabaklarında, içerisine PDGF, LIF, bFGF ve forskolin eklenmiş haliyle bu besiyeri, VAD hayvanlardan farklılaşmamış spermatogoniumların kültürlerinin yapılmasında da başarıyla kullanılmaktadır.

Günümüzde eksperimental çalışmalarda germ hücrelerinin kültürleri için kullanılan solüsyon içeriği sıklıkla aşağıdaki maddelerden oluşur (Jeong 2003):

%10 fetal bovin serum (FBS)
Lösemi inhibitör faktör (mLIF)
Fibroblastik growth faktör (bFGF)
İnsan stem cell faktör (hSCF)
Sodyum pirüvat
L-glutamin
2-merkaptoetanol
Streptomisin
Penisilin
Onkostatin M (OSM)
Platelet-derived growth faktör (PDGF)
İnsan insulin-like growth faktör (IGF-I)

Spermatogoniumların transfeksiyon

Transplante edilmelerinden önce germ hücreleri içerisine bazı genlerin  katılması (transfeksiyon), gen naklinde önemli bir aşama olacaktır. Bu konuda henüz az sayıda çalışma mevcuttur.

Primodial germ hücreleri içerisine gen nakli için çeşitli metodlar tanımlanmıştır. Bu amaçla elektroporasyon yapılmış ama, germ hücrelerinde ciddi hasar meydana getirdiği gözlenmiştir (Watanabe 1997). Lipozom aracılığıyla transfeksiyonun ise etkinliği düşük bulunmuştur. Bir diğer gen nakil yöntemi olan CaPO4 kopresipitasyon metodu %18’lik transfeksiyon etkinliği ile en iyi sonuç veren yöntem özelliğindedir. Bu yöntemle tip B spermatogonium, spermatosit ve spermatidlere başarılı gen aşılamaları yapılmıştır (Hofmann 1994).

Bir çalışmada, VAD rat testislerinden farklılaşmamış tip A spermatogoniumlar izole edilerek, içerisine sodyum bikarbonat, L-glutamin, non-esansiyel aminoasitler, penisilin, streptomisin, gentamisin ve HEPES eklenmiş MEM solüsyonunda bir gece inkübasyona bırakılmış (van Pelt 1996). Bu solüsyon içine ayrıca östradiol, forskolin, LIF, bFGF, PDGF ve %2.5 FCS da eklenerek, spermatogoniumların canlılığı artırılmaya çalışılmış. Ertesi gün plazmid pCMV-SPORT-b gal ile A spermatogonium transfekte edilmiş. 72 saat sonra X-gal boyası ile transfeksiyonun etkinliği analiz edilmiş. Sonuçta tip A spermatogoniumların transfeksiyon başarısının düşük kaldığı gözlemlenmiş ve bu da tip A spermatogoniumların büyük kısmının sessiz fazda bekleyen, sadece %6-9’unun hücre siklusunun S çoğalma-fazındaki hücrelerden oluşmuş olmasına bağlanmış. En başarılı transfeksiyonun Cell fectin (Gibco Life-technology) ve Fuegene 6 (Roche) metoduyla sağlanabildiği anlaşılmış. Transfeksiyonu başarılabilmiş tip A spermatogonium oranları yine de %1 ile %2.8 arasında kalmaktadır.

Transfeksiyonda viral vektörlerin kullanılması (Kay 1997) ya da transfekte edilen gene bir sinyal peptidinin bağlanması (Zanta 1999), gen naklini daha etkin kılacaktır.

Alıcı testisin hazırlanması

Bir testisten alınan spermatogonial kök hücrelerin diğer testise aktarılması rodentlerde, sığırlarda, maymunlarda ve insanda başarıyla gösterilmiştir. Burada önemli olan, alıcı testiste üreyen yeni germ hücrelerinin acaba nakli yapılan hücreler mi yoksa testiste işlemden önce kalan endojen hücreler mi olduğunun ortaya konabilmesidir. Bu amaçla 3 yöntem önerilmektedir: 1) alıcı hayvana busulfan verilerek; veya 2) testislere radyasyon uygulanarak içinin boşaltılması; ya da 3) homozigos dominant W/W hayvanların kullanılması (Brinster and Avarbock 1994; Brinster and Zimmermann 1994; van der Meer 1993).

Busulfan ile testisteki bütün spermatogoniumlar tamamen temizlenememekte, bir miktar daha kök hücre geri kalarak, çoğalabilmektedir. E. Coli LacZ geni üzerine ZF promotor geni birleştirilmiş bir markır transgen taşıyan transgenetik hayvandan elde edilen spermatogonium kök hücreleri kullanılarak, nakledilen kök hücrelerin endojen hücrelerden ayırt edilmesi daha kolay olmaktadır.

Alıcı testislere uygulanan lokal fraksiyone radyasyon ile endojen spermatogonium populasyonu, busulfana göre çok daha büyük oranda temizlenebilmektedir (van der Meer 1993). Dolayısıyla, böyle alıcı testisler işlemden sonra analiz edildiklerinde gözlenilen germ hücrelerinin tamamı, transplante edilmiş kök hücreden kaynaklanmış olarak kabul edilebilir.

Testis içerisinde kök spermatogoniumların tanınması morfolojik ve biyolojik özelliklere dayanılarak yapılır. Morfolojik olarak spermatogoniumlar insan da dahil bir çok canlıda yeterince tanımlanmıştır. En primitif spermatogonium formu olan farklılaşmamış tip A spermatogonium seminifer tubüller içerisinde bazal membrana oturmuş hücrelerdir. Tek tek bulunurlar ya da ikili veya kısa hücre kolonileri yaparlar. Oysa daha ileri farklılaştıklarında 8 ya da daha fazla hücre grupları halinde sitoplazmik uzantılarla birbirlerine bağlı biçimde koloniler yapmış durumda gözlenirler. Farklılaşmamış A tipi spermatogoniumların sadece küçük bir kısmı kök hücredir (Asingle spermatogonia). Bu nedenle, eğer alıcı testiste donör hücreleri tek tek ya da 2’li 4’lü küçük gruplar halinde gözlemleniyorsa, bunlar nakledilen kök hücreler olarak yorumlanırlar.

Biyolojik olarak germ hücresinin kök hücre olduğu kanısına varılması ise, böyle hücrelerin uzun süre yaşamalarıdır. Kök hücrelerin en önemli özelliği nakledildikleri dokuda uzun süre canlı kalarak çoğalabilmeleridir. Gerçektende, eğer kök hücre yoksa bu hayvanlar bir süre sonra infertil kalmakta, ama kök hücre nakli yapıldığında sürekli olarak germ hücresi üretebilmektedirler (de Rooij 1999). Spermatogonium kök hücreleri alıcı hayvana nakledildikten sonra peşi sıra 3 basamakta gelişimlerini sürdürürler: 1) nakledildiklerinin ilk haftasında bu hücreler seminifer tubüller içerisinde rastgele dolaşırlar ve az bir kısmı bazal membrana ulaşabilir; 2) Birinci hafta ile 4. hafta arasında bölünerek, bazal membran üzerinde tek tabakalı bir hücre dizisi oluştururlar; ve 3) Dördüncü haftadan başlayarak çoğalırlar, farklılaşırlar ve spermatogenezi başlatırlar. Yanlara doğru yayılarak, spermatogenez yaygınlaşır (Nagano 1999).

Bir diğer ilginç faktör ise, spermatogonium nakillerinde alıcı hayvanın GnRH analoğu ile tedavi edilmesinin faydasıdır. Gerçekten de, GnRH analogları intratestiküler testosteronu düşürerek endojen spermatogenezin kök hücreler tarafından idare edilmesine olanak sağlamaktadır (Matsumiya 1999). Aynı zamanda, nakledilen spermatogonium sayısını da anlamlı derecede artırırlar (Dobrinski 2001).

Transplantasyon tekniği

Donör kök hücreler testislere seminifer tubüller, efferent kanallar ya da rete testislerden nakledilebilir (Ogawa 1997). Farelerde mikroenjeksiyon yöntemiyle 50-100 ml volüm enjekte edilmesi gerekirken, daha büyük hayvanlarda bu miktar yeterli olmayıp testisi doldurabilmek için 2-5 ml süspansiyonun enjeksiyonu gerekmektedir. Bu nedenle, büyük hayvanlarda ve insanda efferent kanalların ya da seminifer tubüllerin mikroenjeksiyon ile doldurulması pratik olmayıp, bunlarda ultrason eşliğinde rete testis içerisine direk enjeksiyon tercih edilmelidir.

Kök hücrelerin alıcı testis içerisine başarıyla enjekte edilip edilmediklerini anlamak için, sıklıkla ya tek başına ya da hücre süspansiyonu ile birlikte triptan mavisi de testise enjekte edilir. Transplantasyonu takiben alıcı testisteki donör kök hücrelerinin çoğalmaları ise histolojik muayene ile anlaşılır. Son zamanlarda bu amaçla kompüterize görüntüleme yöntemleri önerilmektedir (Dobrinski 1999).

Spermatogonium transplantasyonu konusunda çok sayıda eksperimental çalışma bildirilmiştir. Bunlar arasında yakın tarihli bir uygulamalarında Jeong ve ark. (2003), farelerin testis dokularını STO feeder içeren DMEM (Dulbecco’s minimal essential medium) solüsyonunda 3 ay süreyle inkübe etmişlerdir. İlk hücre kolonisinin 8-21 gün sonra oluştuğu bildirilmekte. Alt kültürleri yapılmaksızın 4 hafta saklanmış, 3 ay içinde ise toplam 8 pasaj tazelenmiştir. Germ hücresine spesifik nuklear antijen ve c-kit ile boyandıklarında nakledilen hücrelerin sağlıklı biçimde çoğaldıkları anlaşılmıştır. c-kit; nakledilen hücrelerin farklılaştıklarını kanıtlayan bir boyama metodudur. Daha sonra 7ml solüsyon (107 hücre/ml) alıcı farenin testisinin rete testis bölgesinden seminifer tubüller içerisine ince cam iğne ile enjekte edilmiş. 2 ay sonra testis çıkarılarak incelendiğinde, spermatogenezin başladığı açıkça gözlenmiştir. Çoğalan hücrelerin transplante hücreler oldukları ise X-gal ve immünohistokimyasal boyamalarla ortaya konmuş.

Sadece aynı türde değil, farklı türler arasında da kök hücre nakillerinin yapılabileceği gösterilmiştir. Örneğin rat kök hücreleri fare testislerinde seminifer tubüller içerisine transplante edildiklerinde germ hücre çoğalması başarılmıştır (Clouthier 1996). Benzer şekilde, hamster kök hücreleri de fare testisine başarıyla nakledilmiştir (Ogawa 1999). Bu çalışmalar, değişik türlere ait spermatogonial kök hücrelerinin transplantasyonlarının mümkün olabileceğini ortaya koymaktadır (xenogeneic spermatogenez).

Yakın tarihte insan spermatogonial kök hücreleri de fare testislerine nakledilmiş ve uzun süre çoğalarak canlılıklarını devam ettirdikleri izlenmiştir (Nagano 2002). Bu çalışmada hem obstrüktif hem de maturasyon duraklaması olan erkeklerin kök germ hücreleri izole edilerek kullanılmış ve alıcı testislerin %73’ünde bu erkeğe ait spermatogoniumların sağlıklı biçimde çoğalabildikleri ve 6 ay canlı kalabildikleri ortaya konmuştur. Ne yazık ki, burada farklılaşmamış spermatogonial kök hücreler 1 ay sonra farklılaşmış spermatogoniumlara dönüşmüşlerse de, daha ileri basamaklara geçememişler, mayozu oluşturamamışlar ve neticede olasılıkla apopitoza uğramışlardır. Ancak bu çalışmadan bazı önemli sonuçlar da elde edilmiştir: 1) nakledilen insan spermatogoniumları fare Sertoli hücreleri tarafından tanınmışlardır; 2) nakledilen hücreler doğru yere göç ederek seminifer tubüller içerisinde bazal membran üzerinde yerlerini almışlardır; 3) kısa süreli de olsa çoğalabilmişlerdir; ve 4) bir kısım kök hücre 6 ay süreyle yaşayabilmiştir. Belki insan kaynaklı bazı büyüme faktörlerinin de ya da insan Sertoli hücrelerinin de alıcı testis içerisine verilmeleri, sonucu daha başarılı hale getirebilecektir.

Bu çalışmada her ne kadar tüm spermatogenetik hücre serisinin gelişimi başarılamamış olsa da, insan germ hücrelerinin fare testisleri içerisine nakledilmeleri mümkün görülmektedir. Burada iki yarar söz konusu olabilir. Birincisi; sitotoksik tedavi alacak erkeklerin spermatogonial kök hücreleri dondurularak saklanabilir; ikincisi ise alıcı testise nakledilen erkeklerin germ hücreleri belki daha uygun bir ortama geçmiş oldukları için, daha sağlıklı çoğalarak mayoza girebilir ve burada olgunlaştıktan sonra alınarak ICSI ile erkeğin kendi çocuğu doğurtulabilir.

Birinci şık günümüzde gerçekleştirilmiştir. İnsanda kanser tedavisi öncesi alınan testis dokularının daha sonra otolog transplantasyonu başarıyla yapılmıştır (Brook 2001). İkinci şık için ise, belki fazla abartılı gibi görülebilir, ama Nagano ve ark. (2000) da yorumlarında benzer sonuçlara işaret etmektedirler. Aynı tür hayvanlarda yapılan çalışmalarda, infertilitenin bu yöntemle tedavi edilebileceği ortaya konmuştur. Örneğin 1999’da Nagano ve ark., infertil fare testisinden aldıkları kök germ hücrelerini diğer infertil fareye nakletmişler ve 4 ay sonra bu hücrelerin farklılaştıklarını ve çoğalarak 19 koloni halinde spermatogenezi başlatabildiklerini ortaya koymuşlardır. Daha sonra, infertil farelerden alınan spermatogonium kök hücreleri, diğer infertil mutant fare testisine aktarıldığında spermatogenez başarılmış, mayoz olmuş ve bunun üstüne fertilizasyon da sağlanabilmiştir (Ogawa 2000). Burada infertil hayvanda infertilite nedeni germ hücrelerine destek sağlayan çevre dokulardaki bir problem olabilir ve bu nedenle germ hücreleri testiküler ortamı sağlıklı hayvana nakledildiğinde fertilizasyon kapasitelerini tekrar kazanmış olabilirler.

Sonuç olarak, spermatogonial kök hücre transplantasyonu infertil erkeklerin tedavisinde yeni bir ufuk açacak şekilde hızla gelişim göstermektedir. Androloji’nin bu yeni alanı, üzerinde yoğun araştırmaların yapılmasını beklemektedir.

KAYNAKLAR

Avarbock MR, Brinster CJ, Brinster RL. Reconstitution of spermatogenesis from frozen spermatogonial stem cells. Nat Med. 1996; 2:693-6.

Barcellona WJ, Meistrich ML. Ultrastructural integrity of mouse testicular cells separated by velocity sedimentation. J Reprod Fertil. 1977; 50: 61-8.

Bellve AR, Cavicchia JC, Millette CF, O’Brien DA, Bhatnagar YM, Dym M. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J Cell Biol. 1977; 74: 68-85.

Brinster RL, Avarbock MR. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91: 11303-7.

Brinster RL, Zimmermann JW. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91: 11298-302.

Brook PF, Radford JA, Shalet SM, Joyce AD, Gosden RG. Isolation of germ cells from human testicular tissue for low temperature storage and autotransplantation. Fertil Steril. 2001; 75: 269-74.

Clouthier DE, Avarbock MR, Maika SD, Hammer RE, Brinster RL. Rat spermatogenesis in mouse testis. Nature. 1996; 381: 418-21.

de Rooij DG, Grootegoed JA. Spermatogonial stem cells. Curr Opin Cell Biol. 1998; 10: 694-701.

de Rooij DG, Okabe M, Nishimune Y. Arrest of spermatogonial differentiation in jsd/jsd, Sl17H/Sl17H, and cryptorchid mice. Biol Reprod. 1999 Sep;61(3):842-7.

Dirami G, Ravindranath N, Pursel V, Dym M. Effects of stem cell factor and granulocyte macrophage-colony stimulating factor on survival of porcine type A spermatogonia cultured in KSOM. Biol Reprod. 1999; 61: 225-30.

Dobrinski I, Ogawa T, Avarbock MR, Brinster RL. Computer assisted image analysis to assess colonization of recipient seminiferous tubules by spermatogonial stem cells from transgenic donor mice. Mol Reprod Dev. 1999; 53: 142-8.

Dobrinski I, Ogawa T, Avarbock MR, Brinster RL. Effect of the GnRH-agonist leuprolide on colonization of recipient testes by donor spermatogonial stem cells after transplantation in mice. Tissue Cell. 2001; 33:200-7.

Feng LX, Chen Y, Dettin L, Pera RA, Herr JC, Goldberg E, Dym M. Generation and in vitro differentiation of a spermatogonial cell line. Science. 2002; 297: 392-5.

Grabske RJ, Lake S, Gledhill BL, Meistrich ML. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J Cell Physiol. 1975; 86: 177-89.

Hahn WC, Counter CM, Lundberg AS, Beijersbergen RL, Brooks MW, Weinberg RA. Creation of human tumour cells with defined genetic elements. Nature. 1999; 400: 464-8.

Hofmann MC, Hess RA, Goldberg E, Millan JL. Immortalized germ cells undergo meiosis in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91: 5533-7.

Izadyar F, Creemers LB, van Dissel-Emiliani FM, van Pelt AM, de Rooij DG. Spermatogonial stem cell transplantation. Mol Cell Endocrinol. 2000; 169: 21-6.

Jeong D, McLean DJ, Griswold MD. Long-term culture and transplantation of murine testicular germ cells. J Androl. 2003; 24: 661-9.

Kay MA, Liu D, Hoogerbrugge PM. Gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94: 12744-6.

Matsumiya K, Meistrich ML, Shetty G, Dohmae K, Tohda A, Okuyama A, Nishimune Y. Stimulation of spermatogonial differentiation in juvenile spermatogonial depletion (jsd) mutant mice by gonadotropin-releasing hormone antagonist treatment. Endocrinology. 1999;140: 4912-5.

Meistrich ML, Trostle PK. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp Cell Res. 1975; 92: 231-44.

Meistrich ML, Bruce WR, Clermont Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp Cell Res. 1973; 79: 213-27.

Morales CP, Holt SE, Ouellette M, Kaur KJ, Yan Y, Wilson KS, White MA, Wright WE, Shay JW. Absence of cancer-associated changes in human fibroblasts immortalized with
telomerase. Nat Genet. 1999; 21:115-8.

Nagano M, Avarbock MR, Leonida EB, Brinster CJ, Brinster RL. Culture of mouse spermatogonial stem cells. Tissue Cell. 1998; 30: 389-97.

Nagano M, Avarbock MR, Brinster RL. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biol Reprod. 1999; 60: 1429-36.

Nagano M, Patrizio P, Brinster RL. Long-term survival of human spermatogonial stem cells in mouse testes. Fertil Steril. 2002; 78: 1225-33.

Ogawa T, Dobrinski I, Avarbock MR, Brinster RL. Xenogeneic spermatogenesis following transplantation of hamster germ cells to mouse testes. Biol Reprod. 1999; 60: 515-21.

Ogawa T, Arechaga JM, Avarbock MR, Brinster RL. Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules. Int J Dev Biol. 1997; 41: 111-22.

Ogawa T, Dobrinski I, Avarbock MR, Brinster RL. Transplantation of male germ line stem cells restores fertility in infertile mice. Nat Med. 2000; 6: 29-34.

Ravindranath N, Dalal R, Solomon B, Djakiew D, Dym M. Loss of telomerase activity during male germ cell differentiation. Endocrinology. 1997; 138: 4026-9.

Rooij DG, Stefanini M. Isolation of the synchronized A spermatogonia from adult vitamin A-deficient rat testes. Biol Reprod. 1996; 55: 439-44.

Schrans-Stassen BH, van de Kant HJ, de Rooij DG, van Pelt AM. Differential expression of c-kit in mouse undifferentiated and differentiating type A spermatogonia. Endocrinology. 1999; 140: 5894-900.

Tegelenbosch RA, de Rooij DG. A quantitative study of spermatogonial multiplication and stem cell renewal in the C3H/101 F1 hybrid mouse. Mutat Res. 1993; 290: 193-200.

van der Meer Y, Huiskamp R, Davids JA, de Rooij DG. Differential effects of fractionated X irradiation on mouse spermatogonial stem cells. Radiat Res. 1993; 135: 222-8.

van Pelt AM, Morena AR, van Dissel-Emiliani FM, Boitani C, Gaemers IC, de van Pelt AM, van Dissel-Emiliani FM, Gaemers IC, van der Burg MJ, Tanke HJ, de Rooij DG. Characteristics of A spermatogonia and preleptotene spermatocytes in the vitamin A-deficient rat testis. Biol Reprod. 1995; 53: 570-8.

Watanabe M, Shirayoshi Y, Koshimizu U, Hashimoto S, Yonehara S, Eguchi Y, Tsujimoto Y, Nakatsuji N. Gene transfection of mouse primordial germ cells in vitro and analysis of their
survival and growth control. Exp Cell Res. 1997; 230: 76-83.

Zanta MA, Belguise-Valladier P, Behr JP. Gene delivery: a single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96: 91-6.